| 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)/技術(shù)服務(wù)導(dǎo)航 | |||||||||
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| 新藥研發(fā)CRO | |||||||||
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細(xì)胞模型構(gòu)建、鑒定、增殖、轉(zhuǎn)染服務(wù)
服務(wù)項(xiàng)目簡介
細(xì)胞轉(zhuǎn)染即把核酸導(dǎo)入細(xì)胞。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩類：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平表達(dá)，通�？沙掷m(xù)幾天（1-3天）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染需要通過一些選擇性標(biāo)記來進(jìn)行反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。目前使用廣泛的是脂質(zhì)體介導(dǎo)法，另有很多商品化的轉(zhuǎn)染試劑可供選擇。
技術(shù)方法、原理及應(yīng)用
轉(zhuǎn)染方法 |
原理 |
應(yīng)用 |
特點(diǎn) |
磷酸鈣法 |
磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
不適用于原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)細(xì)胞毒性小，但技術(shù)要求很高 |
電穿孔法 |
高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
簡單，可重復(fù)性高 對(duì)細(xì)胞有毒副作用 轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清 |
陽離子脂質(zhì)體法 |
帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 |
病毒介導(dǎo)法 |
通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等 |
技術(shù)步驟（脂質(zhì)體法）
（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染法
① 轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，細(xì)胞密度在40-60%，每孔加培養(yǎng)基2 ml （六孔板，無抗生素）。
② 細(xì)胞接種23小時(shí)后用1.5 ml Opti-MEM更換舊的培養(yǎng)液以提高轉(zhuǎn)染效率。
③ 換液1小時(shí)后開始轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，按如下步驟準(zhǔn)備質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混和液：
250 μlyou化培養(yǎng)基稀釋10 μl的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，輕輕混和且在室溫孵育5min；
250 μlyou化培養(yǎng)基稀釋4 μg質(zhì)粒，輕輕混和并在室溫孵育5min；
將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑輕輕混和，室溫培養(yǎng)30min以形成質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混和物。
④ 將質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混和液加入每個(gè)含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，輕輕搖晃孔板混和。
⑤ 培養(yǎng)6-7小時(shí)換液，換成細(xì)胞正常生長所需培養(yǎng)基。
⑥ 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，Real-time-PCR或Western blot檢測表達(dá)效果。
（2）脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染法
① 轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，細(xì)胞密度在30-50%，每孔加培養(yǎng)基2 ml （六孔板，無抗生素）。
② 細(xì)胞接種后23小時(shí)后用1.5 ml Opti-MEM更換舊的培養(yǎng)液以提高轉(zhuǎn)染效率。
③ 換液1小時(shí)后開始轉(zhuǎn)染siRNA，按如下步驟準(zhǔn)備siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和液：
250 μlyou化培養(yǎng)基稀釋10μl的轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000，輕輕混和且在室溫孵育5min；
250 μlyou化培養(yǎng)基稀釋50 nM siRNA，輕輕混和并在室溫孵育5min；
將稀釋的siRNA和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑輕輕混和，室溫培養(yǎng)30min以形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和物。
④ 將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和液加入每個(gè)含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中。輕輕搖晃孔板混和。
⑤ 培養(yǎng)6-7小時(shí)換液，換成細(xì)胞正常生長所需培養(yǎng)基。
⑥ 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，Real-time PCR或Western blot檢測干擾效果。
（3）穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
① 轉(zhuǎn)染方法同前
② 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，消化細(xì)胞，并將細(xì)胞接種于96孔板，每孔1-2個(gè)細(xì)胞以便進(jìn)行單克隆篩選。24小時(shí)后，加入適量抗生素（根據(jù)質(zhì)粒所帶的篩選標(biāo)記）篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。
應(yīng)用領(lǐng)域
- 瞬時(shí)/穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建、鑒定和增殖
- 瞬時(shí)/穩(wěn)定干擾表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建、鑒定和增殖
- 帶有報(bào)告基因或標(biāo)簽的瞬時(shí)/穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建、鑒定和增殖
- 帶有報(bào)告基因或標(biāo)簽的瞬時(shí)/穩(wěn)定干擾表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建、鑒定和增殖
實(shí)用實(shí)例
高表達(dá)載體 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24小時(shí)
服務(wù)周期
我公司在正式接受實(shí)驗(yàn)委托1~2個(gè)月左右交付構(gòu)建好的細(xì)胞株。
服務(wù)咨詢及技術(shù)支持
電話:
Email: [email protected]
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