近兩年，ctDNA液態(tài)活檢在腫瘤診療中的成績(jī)可謂有目共睹，歷次學(xué)術(shù)大會(huì)上專家都給予了的充分的肯定。但另一方面也表達(dá)了對(duì)液態(tài)活檢的期望：ctDNA優(yōu)勢(shì)不少，但是復(fù)雜的變異情況，加之高昂的檢測(cè)費(fèi)用。使得研究階段提出的療效評(píng)價(jià)，病情監(jiān)測(cè)等應(yīng)該充分發(fā)揮液態(tài)活檢取樣優(yōu)勢(shì)的方面，卻離臨床應(yīng)用總有一步之遙。

腫瘤液態(tài)活檢的概念亦起源于CTC，相比ctDNA，發(fā)現(xiàn)最早卻浮沉多年的CTC在幾番打磨后逐漸發(fā)揮出自己的優(yōu)勢(shì)。CTC可是祖師爺級(jí)別的發(fā)現(xiàn)，與孟德?tīng)柗N豌豆得出遺傳定律大概是一個(gè)時(shí)期的事情。早在1869年，CTC在血液涂片中就已經(jīng)被觀察到了，但是是在癌癥病人死后尸檢時(shí)觀察到了CTC的存在。講基因組學(xué)的故事常常從孟德?tīng)栒f(shuō)起，而這篇文獻(xiàn)但凡是想介紹下CTC歷史的文章中必被小輩拱手引用。這時(shí)間可比隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步，人類給癌癥摘掉絕癥的帽子早了一百多年。

隨著CTC分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于CTC的研究再次成為腫瘤領(lǐng)域的焦點(diǎn)。FDA批準(zhǔn)上市了cellsearch掀起了新一輪的熱潮；有人對(duì)PubMed下circulation tumor cell 這一關(guān)鍵詞檢索發(fā)現(xiàn)2013-2015年間全球每周新文獻(xiàn)數(shù)量在20-25篇左右。今天就帶大家一起走進(jìn)這個(gè)大熱點(diǎn)。

基礎(chǔ)篇

CTC從哪里來(lái)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTC） 主要來(lái)源于腫瘤組織自發(fā)脫落的腫瘤細(xì)胞或是人為操作帶入外周血的腫瘤細(xì)胞。

CTC在脫離了腫瘤組織的環(huán)境后往往很脆弱，失去細(xì)胞間相互作用而發(fā)生失巢凋亡，被血液中的免疫細(xì)胞攻擊致死，或者干脆覺(jué)得進(jìn)了循環(huán)系統(tǒng)就像貓咪跳進(jìn)洗衣機(jī)，被血流的剪切力給沖死了。

但是如果CTC發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，或者是形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞團(tuán)（circulating tumor microemboli，CTM） 組團(tuán)外出，那么存活下來(lái)并且發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率則大大增加。

CTC與轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚有許多不清之處，有待驗(yàn)證，但是近年來(lái)CTC的研究揭示了CTC是惡性腫瘤患者出現(xiàn)術(shù)后原位復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的重要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化則可看做是“種子-土壤”假說(shuō)的現(xiàn)代版本。

“種子-土壤”這個(gè)名字一出，相信大家已經(jīng)理解的八九不離十了。原發(fā)腫瘤組織產(chǎn)生“種子”，“種子”找到合適的土壤生長(zhǎng)為新的腫瘤組織。目前研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化就是產(chǎn)生種子的關(guān)鍵一步。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition， EMT） ，顧名思義就是上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過(guò)程。這一過(guò)程本是胚胎發(fā)育的基本過(guò)程，也是炎癥反應(yīng)、傷口愈合等組織修復(fù)再生時(shí)必須的。然而腫瘤細(xì)胞在一定條件下發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化就會(huì)得到新技能：遷移。

上皮細(xì)胞間連接緊密，相對(duì)穩(wěn)定不可移動(dòng)。間質(zhì)細(xì)胞很少有細(xì)胞連接，結(jié)構(gòu)松散分散于細(xì)胞外基質(zhì)中。這一轉(zhuǎn)化是受到嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，基因表達(dá)的改變促使上皮細(xì)胞停止分裂，離開(kāi)原本附著的基底膜，切斷與周圍細(xì)胞的聯(lián)系，細(xì)胞骨架也發(fā)生相應(yīng)的變化以增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力。

CTC與病程

轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的重要特征，CTC的數(shù)量與腫瘤負(fù)荷、病程發(fā)展息息相關(guān)。

這是一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌病人的研究中的案例。虛線表示了影像學(xué)的評(píng)估，PD代表疾病進(jìn)展，PR代表部分緩解，SD表示疾病穩(wěn)定，這一評(píng)價(jià)體系是NCI、FDA等全球多家癌癥研究機(jī)構(gòu)推薦的實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。主要通過(guò)影像學(xué)方法評(píng)估瘤體大小的變化評(píng)價(jià)療效?？梢悦黠@看到在第一個(gè)疾病緩解期，CTC水平已經(jīng)上升，換藥后，CTC的下降也即時(shí)反應(yīng)了藥物有的有效性。

據(jù)有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CTC對(duì)于病情進(jìn)展的指示作用要比影像學(xué)評(píng)估平均早6-8個(gè)月的時(shí)間，可以幫助醫(yī)生及時(shí)掌握病情，調(diào)整治療方案。

技術(shù)篇

在開(kāi)始正題前，我要講一個(gè)警匪的故事，如果你能勉強(qiáng)接受這個(gè)不完備的假設(shè)，或許對(duì)于理解CTC的技術(shù)有一點(diǎn)點(diǎn)幫助。

人體的內(nèi)部仿佛其實(shí)很像一座城池，循環(huán)系統(tǒng)就是承載它運(yùn)轉(zhuǎn)的交通系統(tǒng)，里面跑著的紅細(xì)胞像運(yùn)輸員，數(shù)量極為龐大；白細(xì)胞像治安官負(fù)責(zé)抓壞蛋。城市總有黑暗面，而腫瘤就是黑社會(huì)，黑惡勢(shì)力的暗自成長(zhǎng)就會(huì)影響城市正常的功能，掠奪城市運(yùn)轉(zhuǎn)的社會(huì)資源。黑社會(huì)一方面會(huì)擴(kuò)張自己的領(lǐng)地，而那些小弟里面也有不甘心于此，妄圖自立山頭。

現(xiàn)在復(fù)習(xí)一下之前的內(nèi)容，循環(huán)系統(tǒng)里面會(huì)有一些小流氓是出來(lái)閑逛的，他們比較容易被警察捕獲或是其他原因掛掉。另外一些小流氓或許內(nèi)心已經(jīng)悄悄變化，長(zhǎng)出了一顆王者的心，他們比較耐磋磨，條件適宜的情況下，可以另辟疆土自立門戶。有一些干脆組團(tuán)出發(fā)，抵御循環(huán)系統(tǒng)惡劣的環(huán)境。

CTC的富集

轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的重要特征，CTC的數(shù)量與腫瘤負(fù)荷、病程發(fā)展息息相關(guān)。只是觀測(cè)到CTC并不能作為有效的預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)，科學(xué)的評(píng)價(jià)必須建立在CTC有效富集的基礎(chǔ)上。CTC這種細(xì)胞計(jì)數(shù)即能反映預(yù)后的標(biāo)志物，富集方法對(duì)于檢測(cè)有效性的影響可想而知。然而CTC沉浸在血細(xì)胞的海洋里，CTC含量之低有如在文學(xué)巨著里面挑錯(cuò)別字。那么我們是如何解決這個(gè)問(wèn)題的呢？

方法1，生物富集

負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)募t細(xì)胞與CTC和白細(xì)胞的個(gè)頭差別比較大，分離起來(lái)不成問(wèn)題。主要的難點(diǎn)集中在白細(xì)胞與CTC的分離上。

正向富集——正面出擊，我們直接尋找到小流氓

黑惡團(tuán)伙總會(huì)帶一些別人不帶著的東西，比如舉著個(gè)棒子。我們用特異性尋找棒子的方法來(lái)找到CTC細(xì)胞。

最常用的棒子就是EpCAM，通過(guò)EpCAM富集是一項(xiàng)成熟的技術(shù)，cellsearch系統(tǒng)也是通過(guò)它對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選的。

EpCAM全稱上皮細(xì)胞粘附分子，是細(xì)胞膜上的一種蛋白質(zhì)，正常情況下在多數(shù)上皮組織上都有所表達(dá)。而在造血系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞、腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中沒(méi)有明顯的EpCAM的表達(dá)，是一種特異性很好的分選方法。

負(fù)向富集——排除法，去掉不是壞人的人，剩下的就是壞人

流氓帶著棍棒，當(dāng)然治安官也會(huì)有一些特點(diǎn)比如隨身攜帶專用電臺(tái)，所以只要我們能把帶手臺(tái)的治安官找到，剩下的就是我們要找的CTC啦。白細(xì)胞是雖然種類繁多，但是有一點(diǎn)是一致的，他們都表達(dá)CD45。

CD45是一種白細(xì)胞共同抗原，是細(xì)胞之間溝通信號(hào)傳導(dǎo)上有關(guān)鍵作用，在幾乎所有的白細(xì)胞上都有表達(dá)。警察們互相聯(lián)系的手臺(tái)要保持一致嘛。

方法2，物理富集

運(yùn)輸員警察和小流氓的個(gè)頭不一樣、密度不一樣、帶的電荷不一樣、或者流體中運(yùn)動(dòng)狀態(tài)不一樣，這些物理性質(zhì)也幫助我們分選出CTC。但是這些物理方法主要針對(duì)單個(gè)的CTC，聚成團(tuán)的CTC有可能在分離過(guò)程中因?yàn)槲锢硇再|(zhì)與單個(gè)細(xì)胞不同而無(wú)法篩選出來(lái)。

方法3，結(jié)合著用

先負(fù)向負(fù)極去除絕大多數(shù)白細(xì)胞，再進(jìn)行正向富集，可以大大提高正向富集的效率。

物理富集和生物富集結(jié)合著用，改造生物富集的物理?xiàng)l件也可以提高效率。

在EpCAM以外增加其他的捕獲靶標(biāo)分子，也可以減少因?yàn)镋MT造成的CTC細(xì)胞丟失。

CTC的檢測(cè)

1. 計(jì)數(shù)

對(duì)富集到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、計(jì)數(shù)是最常規(guī)的手段。

目前的鑒定手段也是非常多的，常用的有通過(guò)細(xì)胞染色體變異來(lái)判斷（FISH），或是通過(guò)細(xì)胞表面抗原免疫熒光來(lái)判斷。

但是一旦落實(shí)到計(jì)數(shù)層面就會(huì)有一個(gè)小的問(wèn)題，我們之前說(shuō)過(guò)如果CTC是個(gè)小流氓的話，它的危害程度并不完全一致。有些難成氣候，在循環(huán)系統(tǒng)中存活較短，不會(huì)四處興風(fēng)作浪。然而另一些則懷揣開(kāi)疆僻壤之心，自立門戶，危害極大。

單純的通過(guò)腫瘤細(xì)胞的一些特性只是鑒定了腫瘤細(xì)胞，而將這兩類細(xì)胞一概而論，或許并不是一個(gè)理想的選擇。

2.q-PCR

撬開(kāi)CTC的外殼，發(fā)現(xiàn)他們真實(shí)的狀態(tài)，或許是一種有效的方式。

研究發(fā)現(xiàn)，CTC在表達(dá)上皮細(xì)胞基因的同時(shí)，表達(dá)類似干細(xì)胞及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的基因，這些基因的表達(dá)對(duì)腫瘤患者的預(yù)后評(píng)估有更為精準(zhǔn)的臨床意義。

在對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，高水平表達(dá)CK20或高水平表達(dá)Survivin的患者的總生存期分別是9個(gè)月和10個(gè)月，與CK20和Survivin表達(dá)水平都低的患者總生存期（33.2個(gè)月）相比，總生存期明顯下降。

CTC-CK20或CTC-survivin其中任一個(gè)標(biāo)記物在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平的高低都是對(duì)其總生存期最強(qiáng)的預(yù)測(cè)因子，而對(duì)于二者的綜合評(píng)價(jià)，會(huì)對(duì)患者的預(yù)后有更全面的評(píng)估。

細(xì)胞角蛋白CK家族是上皮性腫瘤較特異的免疫組化標(biāo)志物，CK19和CK20是腫瘤組織免疫組化中常用的標(biāo)志物。survivin是細(xì)胞凋亡的抑制分子，因其有利于細(xì)胞存活而得名“存活素”，正常情況下僅在胚胎和發(fā)育中的胎兒組織中出現(xiàn)，終末分化的成人組織中一般沒(méi)有表達(dá)。

然而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)的過(guò)程，會(huì)使細(xì)胞部分丟失或全部丟失上皮細(xì)胞的特征。因此這一過(guò)程通路上重要基因的表達(dá)結(jié)合干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1也是我們?cè)u(píng)估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的指征。

高靈敏度的qPCR加上合理選擇的marker基因，是對(duì)CTC細(xì)胞的精細(xì)刻畫。讓我們不只是清點(diǎn)數(shù)量，而是在一眾舉棒子的小流氓中可以判斷他們的搞事情的能力到底有多高。

CTC檢測(cè)的應(yīng)用

何時(shí)應(yīng)該進(jìn)行CTC檢測(cè)呢，其實(shí)在治療的任何時(shí)期都可以切入，對(duì)病程達(dá)到動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的目的。其中最具直觀檢測(cè)意義的還是在與療效評(píng)估，術(shù)前術(shù)后或化藥/靶藥用藥前后，無(wú)論療效評(píng)估還是復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)判斷，對(duì)于患者的治療都是非常重要的。

癌癥治療手段日益豐富，已被視為慢性病的當(dāng)下，CTC就是癌癥慢病管理的重要手段，從細(xì)胞層面了解腫瘤發(fā)生發(fā)展情況，早于影像學(xué)評(píng)估及時(shí)調(diào)整治療方案，幫助患者爭(zhēng)取時(shí)間盡早調(diào)整治療方案，才能有更好的帶瘤生存。