CRISPR/Cas系統(tǒng)是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種防御外源性遺傳物質(zhì)入侵的自身免疫機(jī)制，主要分為三種類型：Type I、Type II和Type III。而常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由II型改造而來(lái)，具有核酸酶活性，并能夠通過(guò)向?qū)NA的作用靶向性結(jié)合生物基因組任何區(qū)域的目的基因，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的編輯。該系統(tǒng)最早被開(kāi)發(fā)并最成熟的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，它具有較高的切割活性和保真性，是目前研究最深入的Cas酶之一。它識(shí)別的序列需要臨近3’端有一段序列，即PAM（protospacer adjacent motif）。經(jīng)典的PAM是NGG，而非經(jīng)典PAM序列是NAG（N指 A/T/C/G）【1，2】。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，SpCas9對(duì)靶位點(diǎn)在PAM為NGG時(shí)編輯效率是NAG的15倍；而中國(guó)水稻研究所王克劍教授團(tuán)隊(duì)對(duì)水稻基因組進(jìn)行編輯時(shí)，則發(fā)現(xiàn)SpCas9在NAG位點(diǎn)的編輯效率約為NGG位點(diǎn)的76.44%，且保真性更高【3】。筆者利用人類細(xì)胞對(duì)應(yīng)的報(bào)告系統(tǒng)對(duì)16個(gè)不同的PAM序列進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，SpCas9在部分位點(diǎn)對(duì)PAM為NGA的有效切割效率分別是NGG、NAG位點(diǎn)的0.5倍和2倍【4】。這項(xiàng)研究顯示野生型SpCas9在人類細(xì)胞中可以利用其他非經(jīng)典的PAM，但是效率并不高，也提示挖掘適用范圍更廣的SpCas9是有可能的。

古詩(shī)云：“長(zhǎng)江后浪推前浪，浮事新人換舊人?！蓖瑯樱贑RISPR的“舞臺(tái)”上更是新秀迭出。

2018年1月29日Nature Biotechnology 在線發(fā)表的文章A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast介紹了一種篩選SpCas9突變體的方法——酵母報(bào)告菌株篩選法。利用易錯(cuò)突變?cè)赟pCas9的REC3結(jié)構(gòu)域處制造隨機(jī)突變并構(gòu)建突變體庫(kù)，然后經(jīng)酵母報(bào)告菌株（yACMO-off1–4）進(jìn)行篩選并鑒別出較優(yōu)突變體（圖1）。研究者將篩選出的四個(gè)較優(yōu)突變體進(jìn)行組合突變，產(chǎn)生了最優(yōu)突變體——evoCas9（evolved Cas9）。該突變體除了具有良好的靶向性和切割活性，它最突出的特點(diǎn)是超高的保真度，比之于野生型SpCas9提高了79倍【5】。鑒于此，evoCas9在基因編輯為基礎(chǔ)的基因治療方面將具有重要意義。

無(wú)獨(dú)有偶，2018年2月28日Nature在線發(fā)表了Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity。在該項(xiàng)研究中，為了更快速獲得理想的SpCas9突變體，David Liu團(tuán)隊(duì)使用了獨(dú)門(mén)秘籍——PACE（phage-assisted continuous evolution）（圖2，圖3）。其實(shí)早在2011年，Nature 就刊登了David Liu 的另一篇文章A System for the continuous directed evolution of biomolecules，介紹了PACE定向進(jìn)化技術(shù)【6】。該方法與以往在Cas酶編碼基因序列中人為地制造突變，再利用原核/真核細(xì)胞進(jìn)行功能篩選不同。PACE所使用的大腸桿菌含有誘導(dǎo)突變發(fā)生的質(zhì)粒MP（mutagenesis）和激活后能表達(dá)PⅢ（噬菌體存活的必需基因）的質(zhì)粒AP（accessory plasmid）。研究者們把需要突變的Cas酶蛋白編碼基因序列放進(jìn)噬菌體基因組，轉(zhuǎn)染宿主大腸桿菌。PACE利用噬菌體繁殖周期短的特點(diǎn)，對(duì)Cas酶進(jìn)行大批量、持續(xù)性的突變并定向篩選噬菌體。這項(xiàng)PACE技術(shù)通過(guò)把生物分子的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化和噬菌體的生命周期結(jié)合在一起，一周內(nèi)就能夠?qū)崿F(xiàn)成百上千次的傳代變異，在誘變效率上比傳統(tǒng)方法提高了100倍。

在PACE技術(shù)的助攻下，突變體CRISPR/xCas9 3.7的出現(xiàn)，如雨后春雷，給基因編輯的應(yīng)用發(fā)展帶來(lái)了歷史性的變革。比之于SpCas9，由SpCas9進(jìn)化而來(lái)的xCas9 3.7有著更多的潛力。第一，xCas9 3.7具有更靈活的PAM選擇性，能識(shí)別更大范圍的PAM序列，包括NGG、NG、GAA和GAT；第二，它具有更優(yōu)的靶向轉(zhuǎn)錄激活性和更強(qiáng)的切割基因的能力；第三，新構(gòu)建單堿基編輯器xCas9(3.7)–BE3能夠?qū)χ虏⌒酝蛔兾稽c(diǎn)進(jìn)行C？G→T？A和A？T→G？C的堿基替換，其效率分別高達(dá)73%和71%，明顯優(yōu)于SpCas9–BE3；第四，xCas9 3.7表現(xiàn)出極強(qiáng)的特異性，在PAM為NGG的EMX1基因靶位點(diǎn)處甚至沒(méi)有脫靶。但令人困惑不解的是，xCas9 3.7的PAM序列識(shí)別靈活性、酶活性和保真性同時(shí)得到優(yōu)化的現(xiàn)象突破了以往三者之間存在某種制衡的概念。目前這項(xiàng)工作仍然留下了不少需要回答的問(wèn)題。另外，文獻(xiàn)里報(bào)道的這些突變體（包括之前報(bào)道的基于結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的突變體，如eCas9）平行比較實(shí)驗(yàn)也需要進(jìn)行，如此可讓大家了解這些工具，更好地選擇最合適的工具。

實(shí)現(xiàn)高效的單堿基編輯一直是研究者們孜孜以求的目標(biāo)，David Liu實(shí)驗(yàn)室在2017年報(bào)道過(guò)一種應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞新型的腺嘌呤堿基編輯器ABE，借此編輯器實(shí)現(xiàn)A？T→G？C的轉(zhuǎn)變【7】，當(dāng)然其編輯效率遠(yuǎn)低于xCas9(3.7)–BE3。而中國(guó)科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康研究組在水稻中開(kāi)發(fā)了一種新的腺嘌呤堿基編輯器ABEP2，其識(shí)別靶位點(diǎn)依賴于SaCas9（PAM序列NNGRRT），能夠?qū)λ净蚪M的多個(gè)目標(biāo)基因位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行高效的堿基替換，甚至某些位點(diǎn)的編輯效率達(dá)61.3%，而且ABEP2精確性也很高【8】?？傊?，單堿基編輯器對(duì)精準(zhǔn)編輯目的基因的研究意義非凡，就目前而言xCas9(3.7)–BE3無(wú)疑是 “利器”。

隨著不同國(guó)家、不同地域的研究者們?cè)贑RISPR領(lǐng)域孜孜探索，人類基因組編輯技術(shù)的發(fā)展日新月異，新的方法和工具層出不窮。我們希望研究者們能夠解析xCas9 3.7活性、保真性、PAM序列靈活性三者能夠同時(shí)得到優(yōu)化的機(jī)制，相信在此基礎(chǔ)上，會(huì)有更快速、簡(jiǎn)便、高效、精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)，被更廣泛應(yīng)用于疾病診療上、動(dòng)植物育種等方面。但是，現(xiàn)有的技術(shù)水平距離人類基因編輯的需求仍有一定的距離，而xCas9 3.7（由SpCas9進(jìn)化而來(lái)）的出現(xiàn)猶如利刃出鞘，將會(huì)極大地促進(jìn)基因組編輯領(lǐng)域的進(jìn)程。

這里需要提及的是，多種各具特色的Cas9中，在體內(nèi)有優(yōu)勢(shì)的是SaCas9 (staphylococcus aureus Cas9)。2015年張峰實(shí)驗(yàn)室首先確定了SaCas9在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因編輯作用，并對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的分析。它的基因長(zhǎng)度為3300bp，比SpCas9減少了約25%，這有助于SaCas9被載入腺相關(guān)病毒（AAV），增加了基因治療應(yīng)用的潛力；它識(shí)別的PAM是NNGRRT（N指A、T、C、G；R指A、G），在切割活性和靶向精準(zhǔn)度上的表現(xiàn)均不輸于SpCas9【9，10】。筆者實(shí)驗(yàn)室建立了雙報(bào)告系統(tǒng)來(lái)評(píng)估基因組編輯工具的活性和PAM【11】，分別檢測(cè)SpCas9、SaCas9和FnCpf1在不同位點(diǎn)上的基因組編輯活性，經(jīng)過(guò)多重比較得出結(jié)論——SaCas9擁有比SpCas9和FnCpf1更高的活性【12】。因此，SaCas9憑借其分子量小和活性高的特點(diǎn)，在基因編輯應(yīng)用中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，更為簡(jiǎn)便高效。關(guān)于SaCas9的工程化改造可能對(duì)于基因組編輯為基礎(chǔ)的臨床治療有重大意義。

在功能基因組學(xué)上，CRISPR家族新成員Cpf1因?yàn)槟軌蛲瑫r(shí)完成多個(gè)基因的編輯，所以優(yōu)勢(shì)很明顯【13】。國(guó)際上較為廣泛采用的AsCpfl和LbCpfl對(duì)PAM序列有較為苛刻的要求(TTTN)，極大程度上限制了Cpfl在實(shí)際應(yīng)用中的靶位點(diǎn)的選擇【14，15】。為了增加Cpf1靶序列的選擇范圍，筆者發(fā)現(xiàn)FnCpf1——其識(shí)別的PAM序列更加靈活（KYTV，K為G/T，Y為T(mén)/C，V為A/C/G），在人類細(xì)胞中具有較高的基因組編輯活性，這些為人類（含其他哺乳動(dòng)物）基因組編輯提供了更多的工具【16】。如果能夠進(jìn)一步提高其保真性和活性，可能對(duì)于功能基因組學(xué)研究和臨床疾病治療非常有意義。另外，Cpf1家族對(duì)應(yīng)的CrRNA較短，故而在工業(yè)化合成CrRNA方面更有優(yōu)勢(shì)。

綜合上述，雖然xCas9 3.7的發(fā)現(xiàn)將讓人類具有更加“鋒利”和“通用性更強(qiáng)”的基因組編輯剪刀，但是它可能仍然無(wú)法做到基因組工具中“一統(tǒng)天下”，新的工具仍然需要研發(fā)和優(yōu)化，從而實(shí)現(xiàn)“人定勝天”。(生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）