肌萎縮側(cè)索硬化病 (amytrophic lateral sclerosis，ALS) 俗稱漸凍人癥，是一種漸進(jìn)并致命的神經(jīng)退行性疾病。患者由于運(yùn)動神經(jīng)元的逐步死亡，導(dǎo)致肌肉功能退化，像刷牙、說話甚至呼吸這樣簡單的肌肉運(yùn)動都最終無法進(jìn)行。在患者大腦中出現(xiàn)的異常蛋白沉積是ALS的重要標(biāo)志之一，但是科學(xué)家們并不清楚這些蛋白沉積如何導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。日前，斯坦福大學(xué) (Stanford University) 的研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對影響ALS癥狀的基因進(jìn)行了篩選，研究結(jié)果不但幫助科學(xué)家們進(jìn)一步了解了ALS的發(fā)病機(jī)制，而且為治療ALS提供了新靶點。

在ALS患者中，很常見的一個病因是在C90RF72基因上出現(xiàn)的六核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增(hexanucleotide repeat expansion)，發(fā)生變異的基因會表達(dá)非常容易聚合的二肽重復(fù)(dipeptide repeat，DPR) 蛋白。這種DPR在細(xì)胞中的沉積被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因。

這項結(jié)果發(fā)表在《Nature Genetics》的研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在名為K562的人類細(xì)胞系中進(jìn)行了全基因組敲除篩選 (genome-wide knockout screens)。CRISPR技術(shù)通常被用于修改基因序列，但是在這項研究中，它被用于在細(xì)胞中讓人類基因組中的特定基因失活。然后研究人員將DPR蛋白加入到培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，檢測在細(xì)胞中敲除特定基因讓它們對DPR引發(fā)的細(xì)胞毒性更為敏感還是產(chǎn)生抗性。

研究人員首先在人類細(xì)胞系中對人類基因組中的所有基因進(jìn)行了篩選，他們發(fā)現(xiàn)有幾百個基因能夠?qū)PR的細(xì)胞毒性有正面或者負(fù)面的影響。為了在與ALS更為接近的細(xì)胞環(huán)境下檢驗這些基因的功能，研究人員在模擬ALS的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型中對在人類細(xì)胞中對DPR毒性影響最大的大約200個基因進(jìn)行了進(jìn)一步檢測。經(jīng)過兩輪篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)十多個基因?qū)PR的細(xì)胞毒性有最大影響。

在這十幾個基因中，有幾個基因被敲除之后會對細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的保護(hù)作用。例如，名為RBA7A的基因是一個內(nèi)溶酶體運(yùn)輸基因 (endolysosomal trafficking gene)，它可能在媒介DPR侵入細(xì)胞和在細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)播中起到重要作用。

而另一個受到研究人員關(guān)注的基因是Tmx2，當(dāng)它在細(xì)胞中被敲除時，幾乎100%的細(xì)胞在DPR存在的環(huán)境下能夠存活，而通常只有10%的細(xì)胞能夠存活。

“你可以想象Tmx2 蛋白可能會成為一個好的藥物靶點，” 文章的第一作者，斯坦福大學(xué)的研究生Michael Haney先生說：“如果你有一個小分子化合物能夠通過什么方法抑制Tmx2的功能，那么它有可能成為治療ALS的療法。”

Tmx2蛋白是在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種蛋白，它的功能還沒有得到完全澄清。已有研究認(rèn)為它可能在媒介內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對環(huán)境中應(yīng)激因子的反應(yīng)中起著重要作用，特別是它可能觸發(fā)細(xì)胞死亡。在這項研究中斯坦福的學(xué)者們認(rèn)為Tmx2能夠調(diào)節(jié)其它啟動細(xì)胞死亡程序的基因。

“我認(rèn)為理解Tmx2蛋白在細(xì)胞中的正常功能是下一步需要解決的問題，這會幫助我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)有毒蛋白殺死細(xì)胞時哪些功能受到了影響，并且指出我們應(yīng)該繼續(xù)考察哪些信號通路，” 文章的共同第一作者、斯坦福大學(xué)的研究生Nicholas Kramer先生說。

而在這項研究中使用的CRISPR篩選技術(shù)可以被用來研究其它疾病的信號通路。目前這項研究的團(tuán)隊正在試圖使用同樣的技術(shù)來研究其它由于毒性蛋白沉積造成的神經(jīng)退行性疾病，其中包括亨廷頓病(Huntington’s disease)，帕金森病 (Parkinson’s disease) 和阿茲海默病 (Alzheimer’s disease)?！拔艺J(rèn)為這是CRISPR篩選的一項非常令人興奮的應(yīng)用，而且它才剛剛開始，” 文章的資深作者、斯坦福大學(xué)的遺傳學(xué)教授Michael Bassik博士說。