2017年可謂是基因治療大放異彩的一年，在鐮狀細(xì)胞病、脊髓性肌萎縮癥、血友病等絕癥上，基因治療屢斬奇功，不得不讓人心生期待。而在基因治療大家庭里，CRISPR更是讓科學(xué)家寄予厚望。

科學(xué)家的期待不難理解。CRISPR快速、精準(zhǔn)、體量小、自由度高，不管是用作科研工具還是治療手段都十分得力，不愧“基因魔剪”的稱號(hào)。短短十年內(nèi)，CRISPR已站上風(fēng)口，無數(shù)研究者與企業(yè)跟上時(shí)代的列車，國內(nèi)研究者也不甘落后，在CRISPR治療癌癥的臨床領(lǐng)域，甚至已先于美國一步展開了臨床試驗(yàn)[1]。

然而，這把熊熊燃燒火炬，真的如看起來的那樣旺盛嗎？

近日，斯坦福大學(xué)Matthew H. Porteus教授團(tuán)隊(duì)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在七成的健康人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Cas9蛋白同源物抗體，近半數(shù)人具有Cas9蛋白同源物的抗原特異性T細(xì)胞[2]。Cas9是目前CRISPR技術(shù)使用最廣泛的工具蛋白。這項(xiàng)研究的結(jié)果意味著，在大部分人體內(nèi)原本就存在著針對(duì)Cas9蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，CRISPR/Cas9在實(shí)際人體中的應(yīng)用效果將很難保證，甚至有可能引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。

Matthew H. Porteus教授

CRISPR/Cas9是一種源自于微生物的基因編輯系統(tǒng)，目前使用最廣泛的Cas9蛋白是來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SaCas9和來自化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9。

這兩位可以說是我們?nèi)祟惖睦吓笥?，卻并不是好朋友。它們的出現(xiàn)，往往意味著嚴(yán)重的感染。有研究表明，40%的人類體內(nèi)存在金黃色葡萄球菌[3]，20%學(xué)齡兒童體內(nèi)存在化膿鏈球菌[4]，而針對(duì)這兩種病菌的抗體，幾乎100%的成人都有[5-7]。

這不由得不讓人深思，來自這兩種病菌的Cas9蛋白，是否也會(huì)被我們的身體排斥呢？

研究者檢測(cè)了22份臍帶血樣和12份健康成人外周血樣，利用免疫印跡法對(duì)其中的抗體進(jìn)行檢測(cè)。抗體能夠穿透胎盤屏障，臍帶血一定程度上能夠代表母體的免疫水平。

結(jié)果令人吃驚，在臍帶血中，86%檢出SaCas9抗體，73%檢出SpCas9抗體；在成年人外周血中，67%檢出SaCas9抗體，42%檢出SpCas9抗體?？偟膩碚f，79%具有SaCas9抗體，65%具有SpCas9抗體！

鑒于對(duì)臍帶血和外周血樣本的處理方法有差異，Cas9蛋白抗體可能對(duì)處理方法敏感，兩類樣本出現(xiàn)了略有不同的結(jié)果。實(shí)際上的檢出數(shù)字，可能會(huì)更高。

研究者進(jìn)一步利用細(xì)胞因子捕捉系統(tǒng)（CCS）檢測(cè)了血樣中的Cas9抗原特異性T細(xì)胞。在3份來自健康成人的外周血樣中，46%檢出了SaCas9抗原特異性T細(xì)胞，其中的71%也具有SaCas9抗體；SpCas9則未有檢出。但這并不意味著SpCas9特異性的T細(xì)胞不存在。實(shí)驗(yàn)中，研究者曾檢測(cè)到SpCas9相關(guān)T細(xì)胞的蛛絲馬跡，但是鑒于CCS系統(tǒng)的靈敏度有限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法重復(fù)，只能記為未檢出。

從左至右分別為樣本、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組

實(shí)驗(yàn)采用臍帶血作為陰性對(duì)照組。新生兒并未接觸過抗原，不存在相關(guān)的特異性T細(xì)胞。在CCS檢測(cè)中，接觸了Cas9蛋白也沒有產(chǎn)生特異性T細(xì)胞。這也證明，人血樣中檢測(cè)到的SaCas9抗原特異性T細(xì)胞，是原本就存在的，而不是在檢測(cè)過程中由于首次暴露于抗原產(chǎn)生的。

目前的CRISPR/Cas9技術(shù)有體外編輯和體內(nèi)編輯兩個(gè)方向。在體外編輯時(shí)，一般使用電穿孔轉(zhuǎn)染將編輯系統(tǒng)引入細(xì)胞；體內(nèi)編輯則往往使用病毒載體或者納米粒子包埋的形式。在這種情況下，Cas9蛋白并不會(huì)直接接觸到相應(yīng)的抗體。

但是，Cas9蛋白進(jìn)入了細(xì)胞并不意味著安全。細(xì)胞依舊可以通過MHC抗原遞呈等方式，通知免疫系統(tǒng)內(nèi)部有敵。這讓免疫系統(tǒng)積極清除經(jīng)過Cas9改造的細(xì)胞，導(dǎo)致治療毫無效果?？紤]到治療范圍，如果改造細(xì)胞遍布全身，這種殺敵行為將會(huì)造成嚴(yán)重的全身免疫問題。

這意味著，人的適應(yīng)性免疫將會(huì)成為CRISPR基因療法的巨大壁壘，而且這種風(fēng)險(xiǎn)并不能夠在非人系統(tǒng)中輕易排除[8]。

此文一出，CRISPR技術(shù)的前景再次遭受市場(chǎng)質(zhì)疑?？v然未來可能會(huì)有新技術(shù)解決這個(gè)潛在的問題，但短期內(nèi)，該領(lǐng)域的先鋒技術(shù)公司必將受到?jīng)_擊。周五論文發(fā)表后，Editas股價(jià)下跌0.7%，Intellia下跌2.7%，一直被看好的CRISPR Therapetutics也略有蕭瑟之感[9]。

至于如何解決這個(gè)問題，Porteus教授提出三種思路。加快Cas9的耗竭、免疫抑制、尋找新來源的Cas9蛋白。不管到底哪個(gè)能真的破局，前方的道路必定充滿艱辛。

1999年，美國男孩Jesse Gelsinger在基因治療過程中，因劇烈的免疫反應(yīng)去世，自此結(jié)束了十年間業(yè)界對(duì)基因治療的狂熱追捧。2017年，CRISPR屢登頂級(jí)期刊，2018年預(yù)計(jì)開展的諸多臨床項(xiàng)目看起來大有可為。

一條生命已經(jīng)足以令技術(shù)發(fā)展停滯甚至倒退，希望研究者在科學(xué)的路上慎而又慎，愿CRISPR這把火長久地照亮未來。(世聯(lián)博研(Bioexcellence)世聯(lián)博研Bioexcellence）