細胞治療是將細胞轉(zhuǎn)移到一個病人身上，其目的是改善或治療疾病。細胞治療策略包括分離和轉(zhuǎn)移特定的干細胞群，執(zhí)行效應(yīng)細胞，誘導(dǎo)成熟細胞成為多能性細胞，以及成熟細胞的重新編程。

基因治療是一種新的治療手段，是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。即將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當?shù)氖荏w細胞中，使用外源基因制造的產(chǎn)物來治療疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。

第一個基因療法獲準正式上市。這種CAR-T細胞療法被批準授予諾華制藥以商品名Kymiah用于臨床，治療25歲以下青少年兒童復(fù)發(fā)性或難治性B細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)。FDA在官網(wǎng)稱，這次批準是一次歷史性行動，將為癌癥和其他致命性嚴重疾病開創(chuàng)全新療法。

2013年歐洲Glybera是用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳?。↙PLD）的基因藥物。

通過一種腺相關(guān)病毒（AAV），將產(chǎn)生功能性脂蛋白脂肪酶的基因遞送到患者骨骼肌，患者接受治療后胰腺炎發(fā)病率大大降低，并可以放松飲食限制，提高生活質(zhì)量。2003年，中國賽百諾公司生產(chǎn)的重組腺病毒P-53 (Gendicine) 成功獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理局SFDA 的生產(chǎn)批文，用于治療頭頸部腫瘤的基因療法藥物。

細胞及基因治療用基因載體的分離純化策略：

1.細胞及基因治療的載體，一般使用病毒或者超螺旋質(zhì)粒為載體。載體顆較大，幾十至上百納米。在細胞和基因治療中使用的較多的載體有：腺病毒（AdV），逆轉(zhuǎn)錄病毒（Rv），腺相關(guān)病毒（AAV），質(zhì)粒，慢病毒（LV）等。

2.基因載體顆粒一般加大，所以純化時載量偏低

3.一般基因載體顆粒帶有負電荷。

4.病毒顆粒一般為蛋白衣殼和核酸組成，所以對于剪切力比價敏感。

細胞治療與基因治療常用載體特性

基因載體分離純化工藝：

病毒類載體具有類似的結(jié)構(gòu)表達和擴增系統(tǒng)所以病毒類載體可以使用通用的平臺工藝：

腺病毒載體：

腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70～90 nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。

用于治療的腺病毒在純度、活性以及病毒制品中熱源、支原體、雜蛋白、牛血清、Benzonase 的殘留都有嚴格的指標。這就要求在設(shè)計生產(chǎn)工藝時，需要選用特異性好，高效的方法分離純化腺病毒載體。層析方法純化腺病毒已成為規(guī)模生產(chǎn)的首選方法。以往層析純化腺病毒的方法有很多，如：利用金屬螯和(IMAC Bestarose FF )＋凝膠過濾(S-500 HR、 4FF)、離子交換層析(Q Bestarose XL ) 以及反相層析的方法 等純化方法。 中試或生產(chǎn)規(guī)模的腺病毒純化使用QXL陰離子交換，和Bestarose 4 FF分子篩組份分離。

病毒類載體的通用平臺工藝

病毒類載體的通用平臺工藝：

腺病毒純化工藝：

第一步：細胞分離：腺病毒培養(yǎng)過程中部分腺病毒分泌到培養(yǎng)基中，部分在細胞中。使用離心或中空纖維將培養(yǎng)基上清和細胞分離，細胞采用凍融的方法裂解或去污劑Triton X-100（濃度通常1%）。加入Benzonase 酶切斷染色體DNA，降低樣品粘度。

第二步：澄清，使用中空纖維或離心去除細胞碎片。

第三步：濃縮更換緩沖液，將培養(yǎng)上清（如果上清中的病毒顆粒較多，舍棄影響收率）與澄清后的樣品混合，使用中空纖維濃縮，更換為離子交換的緩沖液。使用Q Bestarose XL其緩沖液為50mM TrisHcl ，5% glycerol ，pH 8.0。

第三步：陰離子交換純化， 使用 Q Bestarose XL ，采用Nacl 洗脫，通常腺病毒在0.4-0.6M Nacl濃度時被洗脫。洗脫后腺病毒在高鹽緩沖液中。

第四步：分子篩組份分離， 使用Bestarose 4/6 FF，上樣一般在5-10%，更換緩沖液。

腺相關(guān)病毒純化：

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus AAV）是微小病毒科，無包膜的20面體結(jié)構(gòu)的病毒。病毒顆粒20-26nm。目前還沒有發(fā)現(xiàn)AAV對人體致病性，重組的AVV去除了96% 的AAV基因組，進一步確保安全性，2012年10月歐洲批準了第一個基因治療藥物Glybera，就是利用重組的AAV藥物。

腺相關(guān)病毒的純化近年來有許多報道；多是采用傳統(tǒng)的氯化銫密度梯度超速離心的方法，由于AAV耐受氯仿，所以可以使用氯仿抽提的方法純化AAV-2 載體。氯化銫、氯仿為有毒試劑，在制藥生產(chǎn)中使用有潛在的危害；親和層析（AVB sepharose， Heparin等）的方法是可以使用于生產(chǎn)，但其產(chǎn)品中的殘留量必須是痕量的及有經(jīng)過認證的嚴格檢測，這就增加了質(zhì)檢的項目和成本，對工藝的穩(wěn)定性提出了更高的要求。Nicole Brument 等2002 年提出了使用2 步離子交換(SP Sepharose HP； Source15Q) 方法純化 AAV病毒。陰離子交換是一個純化病毒顆粒的最佳的方法，其中Q XL 可以分離AAV在表達過程中的空病毒顆粒。

AAV可以按照病毒載體的通用工藝，設(shè)計生產(chǎn)工藝：

QXL：Q Bestarose XL 捕獲病毒顆粒，同時去除空的病毒顆粒

Q Bestarose XL捕獲腺病毒顆粒

腺相關(guān)病毒顆粒較小，使用凝膠過濾層析的介質(zhì)可以使用Chromdex 200 PG精細純化步驟。

Chromadex 200 分離腺相關(guān)病毒

慢病毒純化工藝：

慢病毒包括靈長類慢病毒，如人 類免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ，以及非靈長類慢病毒如貓免疫缺陷病毒( FIV) 、馬傳染性貧血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和維斯納-梅迪病毒(VMV)等。目前，HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被廣泛研究用作基因治療的載體，而其中又以HIV-1最為熱門。成熟的HIV-1 病毒直徑100～120nm、呈20 面體對稱結(jié)構(gòu)、球形，電鏡下可見一致密圓錐狀核心，內(nèi)有病毒RNA 分子和酶，后者包括逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。

不同層析介質(zhì)分離慢病毒載體

質(zhì)粒純化工藝：

質(zhì)粒DNA (pDNA) 又稱基因疫苗。是結(jié)構(gòu)簡單的非病毒載體， 基因疫苗又稱為核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，是指將編碼某種抗原的外源基因與質(zhì)粒載體重組，構(gòu)建出真核表達載體，通過肌肉注射等途徑直接導(dǎo)入動物細胞后，能利用宿主細胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)合成外源抗原蛋白，并誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生對該抗原的體液和細胞免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。由于一般的基因疫苗只含有DNA成份，因此，基因疫苗又常稱為DNA 疫苗(DNA vaccine)。由基因疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，稱為基因免疫(gene immunization) 或核酸免疫( nucleic acid immunization ) 或 DNA 免疫(DNA Immunization)，在質(zhì)粒DNA 生產(chǎn)過程中需要去除的雜質(zhì)如表1 所示的大腸桿菌中的主要成分。

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質(zhì)粒DNA的純化不同于病毒載體的純化，但是不同的質(zhì)?？梢允褂孟嗤墓に嚻脚_。

質(zhì)粒純化分為以下步驟：

質(zhì)粒純化工藝路線

1.發(fā)酵是生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的第一的步驟，也是提高產(chǎn)量的一個較重要的步驟。通過優(yōu)化宿主細胞、培養(yǎng)條件(如：培養(yǎng)基、溫度、攪拌速度、通氣量、pH等) 可以提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。

2.細胞收集可以選用離心、膜過濾的方法。離心是實驗室的常用方法，工業(yè)規(guī)模一般使用連續(xù)流離心機或膜過濾。

3.裂解細胞的方法很多，如超聲破碎、高壓勻漿、凍融、酶裂解、堿裂解。質(zhì)粒DNA 對剪切力和化學(xué)試劑比較敏感，如果剪切力過大，質(zhì)粒DNA 將變性。堿裂解的方法是常用的。NaOH+SDS 可以使得細胞膜溶解，同時促進蛋白質(zhì)、核酸變性，并保持pDNA的活性。在堿裂解后，加入乙酸鉀，調(diào)pH 至5.5。使染色體DNA、蛋白變性沉淀。

4.澄清：傳統(tǒng)使用離心機固液分離后超率濃縮。此步驟既可濃縮也可以更換緩沖液。

去除RNA，使用凝膠過濾層析的組份分離模式，分離質(zhì)粒DNA和RNA。

5.使用特異分離超螺旋和開環(huán)質(zhì)粒的層析介質(zhì)捕獲超螺旋質(zhì)粒。Plasimd Cap Mustang嗜硫親和層析介質(zhì)特異捕獲超螺旋DNA。

6.使用陰離子交換層析介質(zhì)精純，去除內(nèi)毒素等雜質(zhì)。(生物谷Bioon.com）