王永明教授從2010-2013年在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院從事博士后研究，于2013年9月回國(guó)組建實(shí)驗(yàn)室，所以較早地開(kāi)展了技術(shù)改進(jìn)的研究。CRISPR/Cas9技術(shù)主要面臨兩個(gè)核心問(wèn)題，一個(gè)是如何避免脫靶，另外一個(gè)是如何提高編輯效率。在此之前，他曾試圖利用ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)的優(yōu)勢(shì)對(duì)CRSPR的特異性進(jìn)行改造，但是由于學(xué)生剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，沒(méi)有任何實(shí)驗(yàn)技能，進(jìn)展非常緩慢，不久就看到有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室搶先發(fā)表了文章。

于是王永明教授實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向研究提高編輯效率，王永明教授說(shuō)：“在編輯細(xì)胞系的時(shí)候，人們都用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，編輯效率受轉(zhuǎn)染效率和編輯時(shí)間的限制。如果用病毒載體編輯細(xì)胞，可以長(zhǎng)期表達(dá)Cas9和gRNA，但是病毒會(huì)整合到基因組中，不利于后期實(shí)驗(yàn)。我們就想到了用附著體載體（episomal vector）表達(dá)Cas9和gRNA。同時(shí)在載體上表達(dá)嘌呤霉素抗性基因，通過(guò)藥物篩選去除不含有質(zhì)粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞也可以實(shí)現(xiàn)高效的編輯。如果去除篩選藥物，質(zhì)粒會(huì)很快的從細(xì)胞中丟失，細(xì)胞中不再含有外源基因，在干細(xì)胞中最高可以實(shí)現(xiàn)100%的編輯?！?/span>

附著體載體就是在普通質(zhì)粒上加了一段病毒來(lái)源的序列，使得質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中復(fù)制，就像普通質(zhì)粒在細(xì)菌中復(fù)制一樣，這樣就可以長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)Cas9和gRNA，延長(zhǎng)編輯時(shí)間。同時(shí)，他們實(shí)驗(yàn)室還發(fā)明了高通量的測(cè)試gRNA活性的方法，一次可以測(cè)試數(shù)萬(wàn)個(gè)，覆蓋人的所有基因，這個(gè)工作完成后，會(huì)極大的方便這個(gè)領(lǐng)域的人進(jìn)行基因編輯。

王永明教授不僅只單單關(guān)注CRISPR這一種技術(shù)，16年韓春雨發(fā)現(xiàn)了號(hào)稱(chēng)“第四代基因編輯工具NgAgo”，最初文章報(bào)道說(shuō)NgAgo能夠利用磷酸化的單鏈DNA引導(dǎo)進(jìn)行基因編輯，于是王永明教授和南通大學(xué)的劉東課題組利用NgAgo編輯斑馬魚(yú)，發(fā)現(xiàn)只能敲低基因的表達(dá)，不能編輯，也就是說(shuō)不能改變DNA序列。雖然，他們當(dāng)時(shí)對(duì)NgAgo的敲低原理還不清楚，但后來(lái)韓國(guó)的一個(gè)課題組發(fā)現(xiàn)NgAgo能夠靶向切斷RNA，這部分的解釋了其敲低基因表達(dá)的原理。對(duì)于NgAgo是否能像CRISPR1一樣成為強(qiáng)大的基因編輯工具，王永明教授認(rèn)為“利用NgAgo做基因編輯的前景不太樂(lè)觀，主要原因是體外生化實(shí)驗(yàn)證明它沒(méi)有DNA酶切割活性。”

CRISPR久經(jīng)科學(xué)家的考驗(yàn)，它的發(fā)明成功為基因治療帶來(lái)極大的便利，王永明教授對(duì)基因治療的研究也十分感興趣，目前正在研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)治療由于TUBB8基因突變?cè)斐傻牟辉胁挥Y和治療肥厚型心肌病、長(zhǎng)QT綜合征的可行性。

據(jù)王永明教授介紹基因治療方式可以分為兩種，一種是將細(xì)胞從體內(nèi)分離出來(lái)，在體外進(jìn)行突變糾正，然后再輸回體內(nèi)。比如HIV病毒通過(guò)CCR5受體入侵T細(xì)胞，科學(xué)家把T細(xì)胞分離出來(lái)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將CCR5基因敲除，這樣T細(xì)胞就不會(huì)被HIV病毒侵染了。另外一種治療方式是將CRISPR-Cas9系統(tǒng)直接導(dǎo)入體內(nèi)治療疾病。比如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良是由于DMD基因突變?cè)斐傻?，如果將突變的外顯子用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除，基因功能會(huì)得到部分的改善，從而達(dá)到治療目的。雖然這些前景看起來(lái)十分樂(lè)觀，但是CRISPR-Cas9技術(shù)可能會(huì)造成脫靶修飾，帶來(lái)難以預(yù)料的風(fēng)險(xiǎn)。王永明教授表示目前這種應(yīng)用只限于科學(xué)研究，應(yīng)用到臨床還有很長(zhǎng)的路要走。