作為“在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序”的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠解決上述難題。與傳統(tǒng)的全基因組測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序不僅測(cè)量基因表達(dá)水平更加精確，而且還能檢測(cè)到微量的基因表達(dá)子或罕見非編碼RNA，其優(yōu)勢(shì)是全方位和多層次的。與此同時(shí)，測(cè)序巨頭相繼推出新一代測(cè)序儀，為單細(xì)胞測(cè)序提供利器，越來越多與單細(xì)胞測(cè)序有關(guān)的研究也發(fā)表在頂級(jí)期刊上，這些都表明，單細(xì)胞測(cè)序已逐漸成為科研熱點(diǎn)。本文小編就單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用及技術(shù)實(shí)例進(jìn)行了梳理，與大家一起學(xué)習(xí)進(jìn)步。

單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用及技術(shù)實(shí)例

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于癌癥無創(chuàng)診斷

PNAS雜志在線發(fā)表了北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心謝曉亮、白凡課題組與北大腫瘤醫(yī)院王潔團(tuán)隊(duì)合作的研究結(jié)果。他們通過單細(xì)胞基因測(cè)序手段首次報(bào)道了對(duì)于癌癥病人單個(gè)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的全基因組、外顯子組測(cè)序結(jié)果，此項(xiàng)研究對(duì)于揭示癌癥轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義，同時(shí)還為無創(chuàng)癌癥診斷提供了一種新的技術(shù)手段。腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥病人死亡的主要原因。

研究過程中研究人員意外地發(fā)現(xiàn)來自同一個(gè)病人的不同 CTC 都展現(xiàn)出高度一致的全基因組拷貝數(shù)變化模式，和同一病人的轉(zhuǎn)移位腫瘤組織的拷貝數(shù)變化模式一致。這種現(xiàn)象在肺腺癌和小細(xì)胞肺癌的病人中都得到了驗(yàn)證。此外，在不同的肺腺癌病人中， CTC 展現(xiàn)的全基因組拷貝數(shù)變化模式具有高度的相似性。腫瘤的異質(zhì)性長期以來被當(dāng)作是惡性腫瘤的重要特征。 首次在 CTC 中觀察到的高度一致的拷貝數(shù)變異模式將會(huì)改變傳統(tǒng)上對(duì)腫瘤異質(zhì)性的理解，揭示了特定的拷貝數(shù)變異在腫瘤形成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小細(xì)胞肺癌患者的拷貝數(shù)變異模式與那些肺腺癌患者明顯不同，展現(xiàn)出癌種之間一定的特異性。這種特異性可能跟腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移所處的微環(huán)境相關(guān)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為將來基于 CTC 拷貝數(shù)變異來進(jìn)行癌癥病人分型提供了理論基礎(chǔ)。

單細(xì)胞測(cè)序新方法研究原發(fā)性血小板增多癥獲進(jìn)展

國際著名雜志Cell在線刊登了武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究人員的最新研究成果“Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm，”，文章中，研究者研發(fā)出了一種解析單細(xì)胞基因組的新方法，該研究同時(shí)登上了當(dāng)期Cell研究的新亮點(diǎn)。

該文章的并列第一作者宋盧挺，系首批加入武漢大學(xué)——華大基因聯(lián)合培養(yǎng)創(chuàng)新班的七名同學(xué)之一，于2010年3月赴深圳華大基因研究院從事基因組學(xué)研究工作。聯(lián)合培養(yǎng)期間，宋盧挺充分利用華大基因研究院作為全球最大基因組學(xué)研究中心的平臺(tái)優(yōu)勢(shì)，積極把握各種學(xué)習(xí)和鍛煉的機(jī)會(huì)，在2010年的第五屆國際基因組大會(huì)（ICG-V）上作主題報(bào)告，最終成長為華大基因研究院癌癥單細(xì)胞研究的負(fù)責(zé)人。

在本項(xiàng)研究中，以宋盧挺為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人的研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種解析單細(xì)胞基因組的新方法，并將該方法應(yīng)用于原發(fā)性血小板增多癥（ET）的腫瘤內(nèi)部遺傳特征研究，在腫瘤研究上獲得突破性進(jìn)展。

此單細(xì)胞測(cè)序新方法是遺傳異質(zhì)性腫瘤的高精度、全面評(píng)估的一個(gè)非常優(yōu)秀的研究工具，為從單核苷酸水平深入研究癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其診斷、治療提供了新的研究思路。這種新方法和產(chǎn)生的數(shù)據(jù)為鑒定與腫瘤發(fā)展相關(guān)的候選基因提供了科學(xué)依據(jù)，也必將會(huì)推動(dòng)癌癥的遺傳機(jī)理和生物學(xué)過程更深入的研究。此外，這一新方法還可被廣泛用于其他重要的生物研究領(lǐng)域，如組織器官內(nèi)細(xì)胞基因組的異質(zhì)性研究、干細(xì)胞的異質(zhì)性研究、生殖細(xì)胞的遺傳重組研究、胚胎的植入前遺傳學(xué)診斷研究等

多重退火和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles， MALBAC）

由哈佛大學(xué)終身教授、美國科學(xué)院院士謝曉亮（Sunney Xie）教授研發(fā)的多重退火和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，降低PCR擴(kuò)增偏倚，使得單細(xì)胞中93%的基因組能夠被測(cè)序。這種方法使得檢測(cè)單細(xì)胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機(jī)制，生殖細(xì)胞形成機(jī)制，甚至是個(gè)別神經(jīng)元的差異機(jī)制。技術(shù)論文：Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell

技術(shù)簡(jiǎn)介：PCR擴(kuò)增具有偏好型而且基因組具有大量的冗余，造成了基因組測(cè)序準(zhǔn)確性不高。謝曉亮研發(fā)的MALBAC技術(shù)能從一個(gè)細(xì)胞的基因組中，分離出來自單細(xì)胞的DNA，然后添加稱作引物的短DNA分子。這些引物可與DNA的隨意部分互補(bǔ)，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當(dāng)DNA復(fù)制起點(diǎn)。

這些引物由兩個(gè)部分構(gòu)成——一個(gè)包含8個(gè)核苷酸的粘性部分變化多樣，可與DNA結(jié)合，再加上一個(gè)包含27個(gè)核苷酸的共同序列。這一共同序列可防止DNA太 多次拷貝，大大地降低了擴(kuò)增偏倚。通過將自身摻入到新拷貝鏈，從而自身成環(huán)，防止了過度拷貝。利用這種方法，進(jìn)行與加入的引物的DNA復(fù)制時(shí)，可以完成高 達(dá)93%的基因組測(cè)序。

基于芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的單細(xì)胞測(cè)序

由斯坦福大學(xué)Stephen Quake研發(fā)的基于芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的單細(xì)胞測(cè)序，是基于lab on a chip開發(fā)，本技術(shù)設(shè)計(jì)了一種路線，用液體載運(yùn)細(xì)胞通過一連串顯微管道和微閥門，當(dāng)細(xì)胞挨個(gè)進(jìn)入各自的小空位時(shí)，它們的DNA就會(huì)被提取出來，經(jīng)過復(fù)制用于進(jìn)一步分析。

此外，本技術(shù)不僅能分離細(xì)胞，還能用化學(xué)試劑將細(xì)胞混合起來，通過檢測(cè)反應(yīng)過程中的熒光發(fā)射獲得它們的基因編碼。所有這些都能在芯片上完成，不僅操作簡(jiǎn)單，而且成本效益高。

Stephen Quake已利用此技術(shù)完成了第一例人類單細(xì)胞測(cè)序，現(xiàn)在他正利用這項(xiàng)技術(shù)研究精子細(xì)胞中的重組并分析突變率。技術(shù)論文：Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm