人體的免疫系統(tǒng)是一個(gè)非常龐大，而且非常分散、各自為政（decentralized）的守衛(wèi)大軍。盡管有數(shù)十億分工明確的免疫細(xì)胞不停地守護(hù)著人體的安全，但是我們很難明確指出，在某個(gè)時(shí)刻、某個(gè)地方，哪個(gè)免疫細(xì)胞在執(zhí)行什么任務(wù)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科研人員也在不斷加深他們對(duì)人體免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)和了解。研究人體免疫系統(tǒng)是一個(gè)非常龐大的工程，這項(xiàng)工作產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量將會(huì)是人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project）數(shù)據(jù)量的1000億倍。

數(shù)十年來，免疫學(xué)家主要依靠流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry）開展免疫學(xué)研究，并通過不同的熒光標(biāo)簽對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和研究。近8、9年來，該領(lǐng)域又興起了質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry，又名CyTOF）。該技術(shù)主要利用金屬離子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，它為科研人員提供了更多與腫瘤、結(jié)核和瘧疾等病理狀態(tài)下的免疫反應(yīng)有關(guān)的信息。

可是，這些技術(shù)也只能一窺皮毛，無法真正了解T細(xì)胞和B細(xì)胞的詳細(xì)工作情況。據(jù)美國(guó)紐約斯隆凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center in New York City）的分子生物學(xué)家Jennifer Sims介紹，由于這些細(xì)胞都會(huì)表達(dá)獨(dú)特的蛋白質(zhì)分子，比如T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體，所以也能精確地識(shí)別特異性的靶標(biāo)，并做出相應(yīng)的反應(yīng)，而且這一系列生理過程還都在不斷的進(jìn)化之中。免疫細(xì)胞可以說是人體內(nèi)最“有個(gè)性”的細(xì)胞了。

這些細(xì)胞表面受體能夠識(shí)別各種病原體和腫瘤細(xì)胞表達(dá)的各種特異性的分子和抗原。一旦受體偵測(cè)到有害的抗原，它們就會(huì)激活免疫細(xì)胞，使其增殖，并且轉(zhuǎn)移到有害物質(zhì)所在位置，發(fā)動(dòng)免疫攻擊。每一個(gè)受體都是由免疫細(xì)胞內(nèi)大量的基因重排之后編碼而成的，都是獨(dú)一無二的。上個(gè)月，美國(guó)芝加哥市召開了美國(guó)癌癥研究學(xué)會(huì)（American Association for Cancer Research），其中有一個(gè)分會(huì)場(chǎng)就是專門討論T細(xì)胞分析技術(shù)的。在我們一生中，這些與疾病斗爭(zhēng)的免疫細(xì)胞可以表達(dá)出1020個(gè)不同的受體，Sims就是這個(gè)專場(chǎng)的主席。

科研人員希望通過對(duì)這些受體（包括B細(xì)胞受體）的研究能揭開人體免疫系統(tǒng)進(jìn)化，以及對(duì)抗疾病之謎?？墒橇魇郊?xì)胞技術(shù)只能獲得非常粗淺的信息，比如哪些細(xì)胞增多了，哪些細(xì)胞變少了，而免疫受體分析技術(shù)（immune-receptor profiling method）則可以明確指出哪一些細(xì)胞克隆參與了免疫反應(yīng)。據(jù)美國(guó)麻省理工學(xué)院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）的化學(xué)物理學(xué)家Alex Shalek介紹，科研人員為了研究這些特化的受體，以及進(jìn)一步提高單細(xì)胞分析技術(shù)，又開發(fā)出了一大批以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的研究手段。Shalek自己的實(shí)驗(yàn)室也開發(fā)了一系列的工具，來研究這些免疫細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下，彼此之間是如何相互作用的。Shalek設(shè)想，正如DNA僅僅依靠ATGC這四個(gè)“字母”就可以編碼出大量的基因，從理論上來說，如果利用特異性的DNA小片段對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，也可以標(biāo)記無數(shù)抗體蛋白。

而且，這些試驗(yàn)技術(shù)還可以極大地豐富免疫學(xué)的研究手段，比如科研人員就可以借此開展轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究工作等。雖然目前這些技術(shù)還不如流式細(xì)胞技術(shù)那么完善和成熟，但是這些以測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的研究手段可以在任何一個(gè)有測(cè)序儀的實(shí)驗(yàn)室開展，也可以在醫(yī)院、診所里使用。未來隨著測(cè)序儀的小型化和便攜化，還可以在更多的地方得到應(yīng)用?？蒲腥藛T現(xiàn)在至少有6種商業(yè)化的系統(tǒng)可以選擇，也可以設(shè)計(jì)最適合自己需要的試驗(yàn)方法，來研究單個(gè)免疫細(xì)胞里的RNA和蛋白質(zhì)，將隱藏在這些RNA和蛋白質(zhì)里的秘密破譯成DNA測(cè)序儀可以輕而易舉解讀的“明碼文件”。

Sims認(rèn)為，綜上所述，這些新技術(shù)都可以幫助科研人員用更精細(xì)的手段去認(rèn)識(shí)不同免疫細(xì)胞在不同病理微環(huán)境下的活動(dòng)和作用。
 
從熒光標(biāo)記到金屬標(biāo)記

流式細(xì)胞技術(shù)是一種光學(xué)研究手段，它可以將細(xì)胞按照不同的特性進(jìn)行分類，比如根據(jù)細(xì)胞的大小、是否含有顆粒（granularity）、是否表達(dá)某些特殊的分子（可以用熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記這些分子）等。流式細(xì)胞技術(shù)之所以叫“流式”細(xì)胞技術(shù)，就是因?yàn)榧?xì)胞會(huì)“流過”一個(gè)個(gè)激光發(fā)射器和檢測(cè)器，接受這些設(shè)備的檢驗(yàn)和分析。

數(shù)十年來，流式細(xì)胞技術(shù)一直都是免疫學(xué)研究的最主要手段，但它也有自身的劣勢(shì)和局限性。比如，可見光譜的波長(zhǎng)范圍就是一種限制，使得我們可以選擇的標(biāo)記物只有十幾種而已，這么少的標(biāo)記物完全不能研究細(xì)胞群體，或者復(fù)雜的細(xì)胞表型。

2009年，加拿大多倫多大學(xué)（University of Toronto in Canada）的化學(xué)家Scott Tanner想到了一個(gè)好主意，那就是CyTOF。這是一種將流式細(xì)胞技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)，使用金屬來標(biāo)記抗體，這一下子就將標(biāo)記物的數(shù)量提升到了50多種。

美國(guó)斯坦福大學(xué)（Stanford University）的遺傳學(xué)家Garry Nolan等人使用CyTOF一次檢測(cè)了人骨髓細(xì)胞的34種不同的參數(shù)，同時(shí)跟蹤檢測(cè)了不同免疫細(xì)胞對(duì)不同藥物的反應(yīng)。自此，CyTOF一下子就流行開來了。美國(guó)斯坦福大學(xué)的生物化學(xué)家Sean Bendall當(dāng)時(shí)也參與了Nolan的工作，據(jù)他介紹，這種新技術(shù)讓他們一下子進(jìn)入了真正復(fù)雜的單細(xì)胞（及少量細(xì)胞群）研究世界，他們不用再關(guān)注免疫反應(yīng)是在哪里發(fā)生的這個(gè)問題了。DVS Sciences公司是世界上第一個(gè)推出商業(yè)化CyTOF的公司，該公司于2014年被美國(guó)南加州的Fluidigm公司收購(gòu)。

做流式細(xì)胞試驗(yàn)的科研人員通常都會(huì)選擇少數(shù)幾種標(biāo)記物來對(duì)每一種免疫細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，比如使用CD19來標(biāo)記B細(xì)胞，CD4或CD8來標(biāo)記T細(xì)胞等。不過，這種方法只能解決大致的問題，因?yàn)檫@幾種熒光染料的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜都有重疊，所以得到的熒光圖像都不太清晰。可是以色列理工學(xué)院（Technion Israel Institute of Technology in Haifa）的神經(jīng)免疫學(xué)家Asya Rolls想從全局上了解小鼠大腦里的免疫細(xì)胞都在干什么，于是她決定使用CyTOF。

她同時(shí)選擇了44種不同的抗體，結(jié)果有了一個(gè)重大的發(fā)現(xiàn)——有一部分T細(xì)胞表面表達(dá)了大量的CD86分子。在體內(nèi)的其它地方，T細(xì)胞通常都不會(huì)表達(dá)CD86分子，這種分子只會(huì)在其它免疫細(xì)胞表面表達(dá)，起到調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的作用，在腦內(nèi)的T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)CD86分子是非常奇怪的。因此，Rolls認(rèn)為CyTOF是一種非常好的研究手段。

在使用CyTOF發(fā)現(xiàn)了哪一些細(xì)胞、哪一些分子值得關(guān)注之后，再使用流式細(xì)胞技術(shù)就比較合適了。因?yàn)榱魇郊?xì)胞技術(shù)的檢測(cè)速度非?？欤棵肟梢詫?duì)1萬多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，而CyTOF的速度只有每秒1千個(gè)細(xì)胞。而且CyTOF每一個(gè)樣品都會(huì)使用很多種不同的抗體，因此，失敗的代價(jià)也很大。而且經(jīng)CyTOF檢測(cè)過的細(xì)胞也不能再使用了，因?yàn)楹唾|(zhì)譜檢測(cè)一樣，這些樣品需要經(jīng)過氣化才能進(jìn)行檢測(cè)。

但是CyTOF可以對(duì)每一個(gè)細(xì)胞、每一個(gè)化合物進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)，這就可以開展表觀遺傳學(xué)組（epigenome）研究。美國(guó)斯坦福大學(xué)的一個(gè)課題組就開展了這樣的研究。他們?cè)谏蟼€(gè)月報(bào)道，年長(zhǎng)者體內(nèi)免疫細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)異質(zhì)性（epigenetic heterogeneity）更高。這一現(xiàn)象也印證了我們長(zhǎng)期以來的一個(gè)假設(shè)，即人體的免疫系統(tǒng)會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而衰老，細(xì)胞之間在基因表達(dá)方面的差異會(huì)越來越大。

 
DNA標(biāo)記技術(shù)

差不多十年前，開始出現(xiàn)了一大批使用CyTOF的論文，這也引起了美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校（University of California, San Francisco）的物理學(xué)家、微流體設(shè)備（microfluidics device）的開發(fā)者Adam Abate的興趣。據(jù)Abate介紹，他當(dāng)時(shí)也在看Garry Nolan的論文，兩者也在定期座談、交流。這些研究也讓Abate意識(shí)到同時(shí)研究單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)的重要性。CyTOF的出現(xiàn)也催生出了一大批蛋白質(zhì)標(biāo)記物的出現(xiàn)，從過去的十幾個(gè)一下子增長(zhǎng)到了100個(gè)左右。但是Abate認(rèn)為還可以更多一點(diǎn)標(biāo)記物。人體細(xì)胞內(nèi)大約有2萬多個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，還有1萬多個(gè)變異體。所以我們肯定還需要更多的標(biāo)記物。

于是Abate開始嘗試使用另外一種完全不同的標(biāo)記方法，那就是DNA小片段標(biāo)記方法。僅僅依靠ATGC這四個(gè)堿基就可以編碼出無數(shù)個(gè)獨(dú)特的條形碼序列（barcode），用來標(biāo)記各種細(xì)胞和分子。Abate利用這些經(jīng)過了DNA序列標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后將細(xì)胞送入儀器，裂解細(xì)胞，并且將抗體上的標(biāo)記序列裂解成二級(jí)序列（second barcode），然后根據(jù)這些序列判斷出相應(yīng)的細(xì)胞，最后用DNA測(cè)序儀對(duì)這些序列進(jìn)行分析。為了能夠?qū)渭?xì)胞進(jìn)行分析，Abate也用上了微流體設(shè)備。他們開發(fā)出了Abseq技術(shù)，將一個(gè)個(gè)經(jīng)過抗體染色的細(xì)胞注入只有10微米大小的液滴中，這些液滴里含有特定的DNA條形碼，可以對(duì)細(xì)胞和抗體進(jìn)行標(biāo)記。盡管與流式細(xì)胞技術(shù)相比，Abseq技術(shù)的處理速度更慢，但是從理論上來說，Abseq技術(shù)可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞里的無數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析。這樣一來，我們就可以了解在不同的病理狀態(tài)下，都有哪些免疫反應(yīng)在發(fā)生。這對(duì)于腫瘤這種高度異質(zhì)性的疾病尤為重要，因?yàn)槊恳环N腫瘤激活或抑制的免疫細(xì)胞都有可能不一樣。

Abate實(shí)驗(yàn)室的博士后Sam Kim參與了Abseq技術(shù)的開發(fā)過程，他認(rèn)為，只有和其它單細(xì)胞技術(shù)結(jié)合起來，才能發(fā)揮出Abseq技術(shù)的真正實(shí)力。因?yàn)锳bseq技術(shù)的輸出結(jié)果都是測(cè)序儀可以直接讀取的，所以完全可以和其它單細(xì)胞突變信息、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等各個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合起來，以發(fā)揮出更大的作用。

美國(guó)南三藩市（South San Francisco）的Mission Bio生物科技公司已經(jīng)注冊(cè)了Abseq技術(shù)，準(zhǔn)備開發(fā)這種多組學(xué)研究系統(tǒng)。去年10月在美國(guó)佛羅里達(dá)州召開了美國(guó)人類遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（American Society of Human Genetics）年會(huì)，Mission Bio生物科技公司在此次大會(huì)上首次推出了他們的基因突變分析系統(tǒng)，他們現(xiàn)在也已經(jīng)開發(fā)出了蛋白質(zhì)和RNA分析系統(tǒng)。美國(guó)加利福尼亞州的BD生物科技公司也在開發(fā)類似的技術(shù)。去年9月，BD生物科技公司也推出了他們的定制化單細(xì)胞分析產(chǎn)品——Rhapsody系統(tǒng)。據(jù)該公司負(fù)責(zé)Rhapsody系統(tǒng)的產(chǎn)品經(jīng)理Nikhil Rao介紹，他們這套系統(tǒng)不是做全轉(zhuǎn)錄組分析的，而是根據(jù)客戶的要求，重點(diǎn)研究幾百個(gè)轉(zhuǎn)錄體，這就將數(shù)據(jù)量縮減了一個(gè)數(shù)量級(jí)，也節(jié)省了大量的成本。BD生物科技公司計(jì)劃在今年晚些時(shí)候，將他們自己的AbSeq產(chǎn)品也納入Rhapsody系統(tǒng)之中，使其同時(shí)具備蛋白質(zhì)分析能力。
 
DIY你的專屬研究平臺(tái)

據(jù)Shalek介紹，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)還可以用于對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)進(jìn)行研究。這些新技術(shù)也給我們提供了一個(gè)前所未有的新窗口，從全基因組的角度來觀察細(xì)胞在某個(gè)時(shí)刻的基因表達(dá)情況。

現(xiàn)在，研究人員既可以購(gòu)買商業(yè)化的設(shè)備，也可以自己DIY研究平臺(tái)。2015年，美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的兩個(gè)課題組就分別開發(fā)出了inDrop平臺(tái)和Drop-seq平臺(tái)。這兩個(gè)平臺(tái)都使用了微流體設(shè)備，在全基因組層面對(duì)細(xì)胞的RNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析，可以一次對(duì)數(shù)千個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。今年2月發(fā)表的一篇論文介紹了如何利用3D打印技術(shù)打造出一個(gè)緊湊版的Drop-seq平臺(tái)。

在商業(yè)化方面，美國(guó)加利福尼亞州的10X基因組學(xué)公司則推出了一款高端設(shè)備，他們可以在一天內(nèi)，將細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)換成測(cè)序數(shù)據(jù)。英國(guó)的Blacktrace Holdings公司則推出了兩款設(shè)備，一種是整體式設(shè)備，提供了全套服務(wù)；另外一種則是模塊化設(shè)備，可以根據(jù)自己的需要進(jìn)行個(gè)性化的組裝。

不過這些液滴式的技術(shù)也有其弊端。比如無法應(yīng)用于只含有少量細(xì)胞的臨床樣品、如果在每個(gè)液滴里只含有一個(gè)細(xì)胞，就會(huì)浪費(fèi)大量的試劑等。

Shalek和美國(guó)麻省理工學(xué)院的化學(xué)工程師Christopher Love為了解決這些問題，開發(fā)出了Seq-Well這種單細(xì)胞RNA測(cè)序系統(tǒng)。Seq-Well系統(tǒng)可以讓細(xì)胞懸浮在一個(gè)含有8.6萬個(gè)大小不到毫微升（subnanolitre）的小孔的硅芯片上。Shalek指出，你可以把這個(gè)硅芯片想象成家里制作冰塊的冰盒。BD公司也使用了類似技術(shù)，通過這些小孔來固定這些細(xì)胞。

Shalek認(rèn)為，Seq-Well系統(tǒng)最突出的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是便攜性。他們實(shí)驗(yàn)室的工作人員就帶著這套系統(tǒng)去過泰國(guó)，幫助那里的同事分析間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）感染者的細(xì)胞。他們也為南非德班的非洲健康研究所（Africa Health Research Institute in Durban, South Africa）的科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行過Seq-Well系統(tǒng)的培訓(xùn)，讓那里的科研人員使用Seq-Well系統(tǒng)對(duì)采自非洲HIV病毒感染者的淋巴結(jié)樣品進(jìn)行免疫細(xì)胞分析。

關(guān)于采集多組學(xué)數(shù)據(jù)的研究策略，也在不斷發(fā)展中。比如去年，就有兩個(gè)課題組分別使用REAP-seq平臺(tái)和CITE-seq平臺(tái)同時(shí)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)和mRNA分析。美國(guó)紐約大學(xué)Langone醫(yī)學(xué)中心（New York University Langone Medical Center）和德國(guó)波恩的多機(jī)構(gòu)合作組織——西德基因組中心（West German Genome Center）也正在聯(lián)合開發(fā)類似的技術(shù)。Langone醫(yī)學(xué)中心方面的負(fù)責(zé)人Pratip Chattopadhyay表示，客戶可以將他們的試驗(yàn)樣品寄給他們，由他們來做單細(xì)胞分析。西德基因組中心則主要負(fù)責(zé)組織專家組提供技術(shù)咨詢。

德國(guó)波恩的德國(guó)神經(jīng)變性疾病中心（German Center for Neurodegenerative Diseases in Bonn）的腫瘤免疫學(xué)家Joachim Schultze表示，這是一個(gè)發(fā)展得非?？斓念I(lǐng)域，涌現(xiàn)出了大量的新技術(shù)、新方法。沒人能夠預(yù)測(cè)在十年之內(nèi)，這個(gè)研究領(lǐng)域會(huì)發(fā)展到什么地步。