眾多研究表明，免疫檢查位點(diǎn)抑制劑能夠改善多種腫瘤治療后的總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）[1]。而腫瘤的微環(huán)境特征（TME）通常會(huì)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療響應(yīng)有關(guān)：比如在TME中PD-L1的表達(dá)，會(huì)與不同腫瘤類型的抗PD-1/PD-L1療法的療效相關(guān)[2，3]。另外，TME也有可能會(huì)限制效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的滲入，從而減弱T細(xì)胞的擴(kuò)張，或直接降低浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的存活力[4]。然而，對(duì)于檢查點(diǎn)抑制劑是如何介導(dǎo)免疫激活來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的突變分布和影響腫瘤微環(huán)境的機(jī)理仍然知之甚少。

對(duì)此，來(lái)自美國(guó)紐約紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究團(tuán)隊(duì)在2017年11月的Cell雜志上發(fā)表的研究成果表明： 基于全外顯子測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及T細(xì)胞受體（TCR）測(cè)序的多組學(xué)聯(lián)用策略，對(duì)68個(gè)患有晚期黑色素瘤患者在使用Nivolumab藥物（Nivo；抗PD-1藥物）前后其基因組信息變化進(jìn)行了綜合性分析。該研究結(jié)果揭示了Nivolumab藥物的作用機(jī)制和腫瘤微環(huán)境進(jìn)化間的關(guān)系[5]。

研究亮點(diǎn)

1. 作為一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)揭示了抗PD-1治療的分子機(jī)制；

2. 抗PD-1治療能誘導(dǎo)腫瘤突變負(fù)荷的發(fā)生變化；

3. 用藥前后腫瘤基因表達(dá)模式變化顯著并與臨床反應(yīng)相關(guān)聯(lián)；

4. 在免疫檢查點(diǎn)阻斷之后，T細(xì)胞受體數(shù)目發(fā)生改變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在Nivolumab藥物（Nivo）處理前后黑色素瘤的基因組特征的改變

首先，研究人員對(duì)68位黑色素瘤患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序（平均測(cè)序深度168X），其中有35位病人曾經(jīng)使用過(guò)ipilimumab（Ipi）進(jìn)行治療?？梢钥吹?，病人中其突變數(shù)目的中位值為183，但在有或無(wú)ipilimumab治療史的患者之間并沒(méi)有顯著差別。另外，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)定義的用于分析黑色素瘤突變亞克隆結(jié)果可知，在有或無(wú)ipilimumab治療史的患者間對(duì)Nivolumab藥物（Nivo）的反應(yīng)也并無(wú)顯著差異。特別地，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤的突變負(fù)荷跟接受過(guò)Ipi治療的患者其治療后總生存期無(wú)關(guān)，而在這些接受過(guò)Ipi治療的患者中其腫瘤克隆的突變數(shù)目偏低。

隨后，作者對(duì)接受Nivo治療的患者作出深入分析，判斷使用Nivo藥物是否會(huì)對(duì)腫瘤突變負(fù)荷與瘤內(nèi)異質(zhì)性產(chǎn)生影響。結(jié)果表明，在Nivo藥物使用四周后，基因突變數(shù)目以及腫瘤抗原數(shù)目均發(fā)生顯著下降（圖1）。

隨后，作者進(jìn)一步分析了腫瘤構(gòu)成的改變與Nivo藥物治療的關(guān)系：將樣本分為兩組，即Nivo藥物處理前與處理后。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同響應(yīng)組之間的腫瘤克隆構(gòu)成存在明顯變化。

Nivolumab藥物治療前后的轉(zhuǎn)錄組水平分析

使用RNA-seq對(duì)患者腫瘤組織RNA進(jìn)行表達(dá)差異基因分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的基因均為免疫相關(guān)基因，暗示著在用藥前就存在針對(duì)于腫瘤的免疫識(shí)別。另外，作者通過(guò)GO注釋，發(fā)現(xiàn)這些高表達(dá)基因在T細(xì)胞活性增強(qiáng)以及淋巴細(xì)胞聚集功能方面存在富集（圖3）。

與此同時(shí)，作者做出這樣的假設(shè)：即抗PD-1療法能夠誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)錄水平以及整個(gè)腫瘤微環(huán)境的改變。對(duì)此，作者針對(duì)性地分析了在Nivo治療之后，黑色素瘤中基因表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯示，475個(gè)基因存在顯著表達(dá)差異，并且這些基因中大多數(shù)與免疫調(diào)控相關(guān)。同時(shí)，眾多免疫檢查位點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生上調(diào)。而對(duì)于發(fā)生表達(dá)下調(diào)的基因，則大多屬于腫瘤生長(zhǎng)通路上的基因，包括神經(jīng)黑色素通路、細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂以及翻譯過(guò)程等。另外，作者也觀察到了跟治療相關(guān)的一些細(xì)胞改變，如CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)目發(fā)生明顯增加，而M1型巨噬細(xì)胞數(shù)目則發(fā)生下降（圖4）。

黑色素瘤的瘤內(nèi)T細(xì)胞的豐度、活性以及多樣性分析

接下來(lái)，研究人員想要去了解T細(xì)胞在使用Nivo藥物之后的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程， 因此使用了高通量測(cè)序技術(shù)，針對(duì)性地對(duì)T細(xì)胞受體（TCR）的β鏈上的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR3區(qū)）進(jìn)行深度測(cè)序。使用的樣本為Nivo藥物處理前的腫瘤樣品以及處理四周后的腫瘤樣品。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的比例出現(xiàn)提高，而這與免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。與此同時(shí)，作者使用了richness，evenness兩種多樣性評(píng)估指數(shù)進(jìn)行樣本多樣性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其多樣性存在改變。并且，與是否使用過(guò)ipilimumab（Ipi）進(jìn)行治療有關(guān)。另外，為了進(jìn)一步確定T細(xì)胞受體的抗原結(jié)合能力，作者緊接著分析了抗體中V基因與J基因的組合類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療中的非Ipi治療患者其V、J基因組合的多樣性指數(shù)要顯著降低。以上結(jié)果表明：T細(xì)胞群體的多樣性變化，更多的是由其CDR3區(qū)上的氨基酸序列所決定的，即抗原識(shí)別特性（圖5）。

最后，作者通過(guò)評(píng)估T細(xì)胞群體的分布改變與腫瘤突變克隆的響應(yīng)，預(yù)測(cè)新抗原丟失數(shù)目與T細(xì)胞克隆擴(kuò)增數(shù)目之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞克隆的動(dòng)態(tài)變化跟腫瘤克隆動(dòng)力學(xué)存在關(guān)聯(lián)。此外，作者通過(guò)計(jì)算新抗原比例發(fā)現(xiàn)：抗原突變的產(chǎn)生受到一定的選擇壓力。以上結(jié)果暗示，T細(xì)胞能夠有效地清除腫瘤細(xì)胞表達(dá)的新抗原免疫原性（圖6）。

總結(jié)討論

研究人員通過(guò)將多種組學(xué)研究方法相結(jié)合的手段，對(duì)實(shí)施抗PD-1療法的黑色素瘤患者進(jìn)行全方位、多維度的腫瘤基因組以及腫瘤微環(huán)境改變的深入探究。該研究結(jié)果有利于剖析免疫檢查位點(diǎn)抑制劑的作用機(jī)理，并且為今后免疫檢查位點(diǎn)的研究與設(shè)計(jì)工作打下基礎(chǔ)。(生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）