中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科應(yīng)建明主任研究團(tuán)隊(duì)新近在Cancer letter上發(fā)表的題為“Major challenges related to tumor biological characteristics in accurate mutation detection of colorectal cancer by next-generation sequencing”的一篇文章，對(duì)NGS檢測(cè)CRC突變所遇到的樣本選擇問(wèn)題進(jìn)行了梳理和匯總，該文章可以為我們帶來(lái)一些思考。

文章回顧性研究了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科的756例結(jié)直腸癌樣本。其中9例樣本由于腫瘤細(xì)胞比例過(guò)低（<10%）或DNA質(zhì)量較差而舍棄。最終利用NGS技術(shù)，對(duì)747例樣本進(jìn)行了22個(gè)腫瘤相關(guān)基因（Ampliseq Colon and Lung Cancer Panel）的檢測(cè)。747例樣本中包括709例單一樣本、22例來(lái)自11對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的配對(duì)樣本、10例來(lái)自5對(duì)同一腫瘤不同蠟塊的樣本及6例來(lái)自3對(duì)化療前后的配對(duì)樣本。

研究結(jié)果顯示，53.0%（396/747）的樣本，存在RAS突變(KRAS或NRAS突變)。在57.1%（431/747）的樣本中發(fā)現(xiàn)了RAS/BRAF/PIK3CA突變(KRAS、NRAS、BRAF或PIK3CA突變)。有84.2%（629/747）的樣本均檢測(cè)到了突變(22個(gè)檢測(cè)基因中的任意突變)。

在所有22個(gè)的基因中，最常見(jiàn)的突變基因是TP53(56.2%)，其次是KRAS(48.6%)、PIK3CA(9.6%)、FXBW7(5.1%)、NRAS(4.7%)、SMAD4(3.7%)和BRAF(3.5%)。

研究者通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析，對(duì)我們?nèi)绾芜x擇合適的CRC樣本進(jìn)行NGS檢測(cè)，給出了如下提示：

1、對(duì)樣本中腫瘤細(xì)胞含量進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估是至關(guān)重要的。

研究者根據(jù)腫瘤細(xì)胞含量將樣本分為了三組：第1組（27例樣本）腫瘤細(xì)胞含量為10%-19%；第2組（192例樣本）腫瘤細(xì)胞含量為20%-30%；第3組（528個(gè)樣本）腫瘤細(xì)胞含量>30%。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是從RAS、RAS/BRAF/PIK3CA突變，還是所有突變來(lái)看，第3組都比第1組的突變率高（p<0.05）。將活檢樣本和手術(shù)樣本分組分析后，在前者中仍然得出了以上結(jié)論，但在后者中三組樣本的突變檢出率并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

以上結(jié)果表明，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞含量≥10％的手術(shù)樣本都可適用于NGS檢測(cè)。但在分析腫瘤細(xì)胞含量低的活檢樣本時(shí)，應(yīng)特別注意假陰性的可能，特別是當(dāng)樣本很小，或伴有壞死、粘液湖、大量淋巴細(xì)胞或其它檢測(cè)（如免疫組化）已有很多樣本消耗者。

2、CRC的腫瘤細(xì)胞存在分子遺傳學(xué)（突變）異質(zhì)性。與RAS突變相比，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性更易發(fā)生在PIK3CA突變的腫瘤中。

腫瘤的分子遺傳學(xué)（突變）異質(zhì)性對(duì)CRC患者的靶向治療是一大挑戰(zhàn)。研究者借鑒了Normanno等報(bào)道的異質(zhì)性評(píng)分（heterogeneity score，HS）值來(lái)評(píng)估腫瘤內(nèi)突變的異質(zhì)性。

研究結(jié)果顯示，PIK3CA的HS值明顯低于KRAS、NRAS和BRAF。通過(guò)對(duì)RAS和PIK3CA同時(shí)突變的47例樣本的分析發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因的突變豐度要顯著低于相應(yīng)的RAS基因的突變豐度。

這些數(shù)據(jù)表明，與RAS突變相比，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性更可能發(fā)生在PIK3CA突變的腫瘤中。同時(shí)也支持RAS突變常發(fā)生在CRC的早期階段，而PIK3CA突變可能發(fā)生在腫瘤進(jìn)展期的理論。

3、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的突變狀態(tài)存在高度一致性，當(dāng)轉(zhuǎn)移腫瘤無(wú)法獲得時(shí)，可用原發(fā)腫瘤替代檢測(cè)。

研究的747個(gè)樣本中，原發(fā)性腫瘤樣本656個(gè)，轉(zhuǎn)移性腫瘤樣本91個(gè)，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的突變狀態(tài)并沒(méi)有顯示出差異。進(jìn)一步分析非配對(duì)的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA突變的HS值，也沒(méi)有觀察到顯著差異。

此外，分析11對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶配對(duì)樣本，11例配對(duì)樣本中的10例突變狀態(tài)相同。

4、化療可能會(huì)影響CRC的突變狀態(tài)。

對(duì)未進(jìn)行化療患者的624例樣本及化療后患者的105樣本的分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是RAS突變、RAS / BRAF / PIK3CA突變，還是含有任意突變的突變檢出率，均是化療前高于化療后。由于化療會(huì)殺死腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤細(xì)胞含量而導(dǎo)致假陰性，所以進(jìn)一步分析了腫瘤細(xì)胞比例>20%的樣本，仍然可得出以上結(jié)論，提示化療可能會(huì)影響CRC的突變狀態(tài)。

對(duì)其中一個(gè)病例（case470）化療前后的兩個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果的分析顯示，化療后，之前的TP53突變消失，出現(xiàn)了另一個(gè)新的TP53突變，其原因可能與取樣差異或化療藥物誘導(dǎo)基因變異有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，腫瘤細(xì)胞含量低、腫瘤異質(zhì)性以及化療都可能會(huì)影響NGS檢測(cè)CRC基因變異的準(zhǔn)確性，選擇合適的樣本是NGS檢測(cè)的關(guān)鍵。此外，多區(qū)域、重復(fù)活檢或使用循環(huán)腫瘤DNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可能有助于NGS更加準(zhǔn)確的檢測(cè)CRC中的突變。(生物谷Bioon.com）