泛素（ubiquitin，UB）分子共價結合到胞內(nèi)蛋白上，進而調(diào)控該蛋白的命運，例如調(diào)控蛋白降解、改變亞細胞結構定位、調(diào)節(jié)酶的活性等等。這一過程中，UB首先被E1激活，在UB的活性半胱氨酸位點與羧基端形成硫酯鍵。隨后E2結合UB并由E3將UB連接到目標蛋白上。起初人們認為Uba1是單一的E1，后研究發(fā)現(xiàn)Uba6也是一種可替代或者說非典型的E1，這兩種E1在很大程度上具有重疊性，是可交互使用。后來的研究表明，Uba6在胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能、代謝活動等過程中發(fā)揮著重要的作用。到目前為止，只有少數(shù)蛋白如RGS4、RGS5、Shank3等依賴于Uba6激活其泛素化，但Uba6如何起始泛素化的過程仍然未知。為了更好的研究Uba6在泛素化中扮演的角色，西北大學的研究人員采用正交泛素轉(zhuǎn)移試驗，以區(qū)分胞內(nèi)Uba1與Uba6的泛素化目標蛋白。 
  
研究策略：改造UB 使得突變型UB（xUB）不能被野生型Uba1或Uba6激活，同時改造Uba1和Uba6上UB的結合位點，使得突變型Uba1（xUba1）和Uba6（xUba6）恢復對xUB的激活能力并且喪失對野生型UB的激活能力。由此，xUB可以通過xUba1或xUba6激活并傳遞給E2、E3以及下游目標蛋白。在表達帶FLAG標簽的xUba1或xUba6細胞株中分別表達帶HBT標簽的xUB，使用Ni-NTA樹脂及streptavidin-agarose純化xUB連接的蛋白，隨后采用質(zhì)譜鑒定，篩選出Uba1或Uba6可能的激活底物。

  
結果部分：體外實驗表明，該研究體系中改造過后的xUB-xUba1/ xUB-xUba6的功能接近于wtUB-wtUba1/ wtUB-wtUba6，并且可以轉(zhuǎn)移給wtUBE2D2/UbcH5b（E2）。利用慢病毒載體表達帶HBT標簽的xUB及wtUB，并感染HEK293細胞。實驗證明在HEK293細胞內(nèi)xUB-xE1與UB-E1一樣具有良好的正交性。下一步純化HBT-xUB連接的胞內(nèi)蛋白并用質(zhì)譜檢測。在表達xUba6的細胞中鑒定出與xUB相連的蛋白有697個，在表達xUba1的細胞中鑒定出與xUB相連的蛋白有527個，其中有258個蛋白可能為xUba1與xUba6共同的底物，與之前的假設——Uba1與Uba6功能上存在重疊相一致。進一步生物信息學分析顯示線粒體功能障礙、Cdc42信號傳遞與RhoA信號傳遞可能只與Uba6的底物相關，而氧化脅迫、AMPK信號傳遞可能只與Uba1有關。隨后研究人員選取了ezrin、RNA結合蛋白CUGBP1等進行生化實驗驗證，結果表明ezrin與RNA結合蛋白CUGBP1確實為Uba6的底物，調(diào)節(jié)其發(fā)生K48位的多聚泛素化，從而被蛋白酶體降解。

  
由于ezrin控制上皮細胞形態(tài)發(fā)生的基底部極性，研究人員推測Uba6引起的泛素化是否與上皮細胞腺泡的形態(tài)發(fā)生有關。MCF-10A細胞在富含層粘連蛋白基膜如Matrigel上培養(yǎng)時可以分化形成高度組織化的acini-like球狀結構。這一體系被廣泛用于研究上皮腺泡形成中各基因的功能。在MCF-10A細胞中敲除uba6以及敲除uba6并回補uba6，結果發(fā)現(xiàn)敲除uba6上皮細胞腺泡顯著增大，并且接近30%的細胞不能形成典型的內(nèi)腔結構。免疫熒光顯微鏡下觀察可以看到，對照組細胞中ezrin在質(zhì)膜上顯著富集，而在uba6敲除細胞中ezrin分布較彌散。而uba6回補后能顯著回復細胞的表型例如增大的球狀體、ezrin亞細胞結構分布散亂等，顯示Uba6對上皮細胞acini-like的形態(tài)發(fā)生具有重要的調(diào)控作用。

  
這項研究采用正交泛素轉(zhuǎn)移技術，首次描述并且區(qū)分了兩種E1——Uba1和Uba6的靶標蛋白以及相關的細胞信號傳遞途徑，Uba1和Uba6的底物存在一定程度的交叉又各有其特異性，可能起始不同的E1-E2-E3途徑從而影響特定蛋白的泛素化。同時，研究人員認為，這種正交泛素轉(zhuǎn)移技術可以被進一步拓展，用于鑒定E2和E3的特異性底物，更大程度上揭示E1-E2-E3在調(diào)節(jié)不同細胞功能上發(fā)揮的作用。 
  
  
值得一提的是，在蛋白質(zhì)修飾和表觀遺傳領域，景杰生物是國內(nèi)唯一一家以表觀遺傳學和高通量蛋白質(zhì)組學為核心業(yè)務的高科技企業(yè)公司，開發(fā)有全球種類最多、覆蓋面最全的組蛋白修飾抗體和蛋白質(zhì)修飾泛抗體以及國內(nèi)工業(yè)界最先進的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜平臺。公司開展結合自身開發(fā)的高靈敏度蛋白質(zhì)修飾類泛抗體及抗體樹脂，與高通量蛋白質(zhì)組學技術服務為國內(nèi)外科研客戶提供了優(yōu)質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)組學分析，為該領域的進步做出了獨有的貢獻。（生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）

小編推薦會議  2019臨床質(zhì)譜與高端醫(yī)學檢驗發(fā)展論壇

http://meeting.世聯(lián)博研Bioexcellence/2019CMSPMT？__token=liaodefeng