在蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法中，質(zhì)譜獲得的是多肽序列結(jié)構(gòu)的信息；那么用質(zhì)譜是否可研究大分子蛋白的結(jié)構(gòu)信息？近幾年來，董夢秋實驗室在中國做出了多項先驅(qū)性工作，主要集中在化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜領(lǐng)域。在用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)屢創(chuàng)佳績的當(dāng)下，很多研究者都把樣品一分為二，一份做冷凍電鏡，一份做交聯(lián)質(zhì)譜。那么交聯(lián)質(zhì)譜如何讓結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究如虎添翼？

pLink和交聯(lián)質(zhì)譜在國際上的影響力

與化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)緣

董夢秋曾在著名蛋白質(zhì)組學(xué)大師John Yates教授實驗室做博士后，Yates教授最享譽全球的工作是開發(fā)了SEQUEST蛋白質(zhì)組學(xué)“鳥槍法”鑒定軟件。當(dāng)時，有位合作者研究一種HSP90的復(fù)合體，認為其結(jié)合方式同以前報道的不同，希望能用化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜（CXMS）判斷復(fù)合體中兩個蛋白的結(jié)合界面。那時只有常規(guī)肽段鑒定工具，董夢秋用18O標(biāo)記區(qū)分交聯(lián)肽段和普通肽段，通過大量搜索和輔助人工判斷，終于完成了任務(wù)。雖然研究很有意思，但因為沒有專用軟件工具，做起來很費勁。

董夢秋2007年到北京生命研究所（NIBS）做PI，找到了中科院計算所賀思敏教授，從此董夢秋開始了與pFind 團隊的長期合作。他們致力于開發(fā)交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，打造出已經(jīng)成為業(yè)界標(biāo)桿的pLink軟件和一系列工作流程。

交聯(lián)質(zhì)譜的價值

董夢秋談到，“近年來質(zhì)譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的重要性愈發(fā)彰顯?，F(xiàn)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)家研究的蛋白質(zhì)復(fù)合體越來越大，種類、狀態(tài)越來越多，即使有強大的電鏡和晶體學(xué)手段也不一定能看清所有的關(guān)鍵性的結(jié)構(gòu)細節(jié)、狀態(tài)間的差異，或者不能確定組成亞基的化學(xué)計量比，他們的需求帶動了交聯(lián)質(zhì)譜、native MS和氫氘交換等技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。看看結(jié)構(gòu)文章的作者名單就知道，很多都有質(zhì)譜專家的身影?！?/p>

董夢秋實驗室和pFind 團隊的合作開展不到一年，Ruedi Abersold團隊就在Nature Methods上發(fā)表了他們開發(fā)的交聯(lián)質(zhì)譜鑒定軟件，但該軟件有一個明顯的缺陷：沒有假陽性率的估算，無法判斷鑒定結(jié)果的好壞。2012年董夢秋實驗室和pFind團隊合作開發(fā)的pLink軟件在《Nature Methods》發(fā)表。在這項工作中快速尋找候選肽、譜圖打分、評價、控制假陽性率等環(huán)節(jié)一步到位。該軟件和配套的方法流程還有一大好處：不要求必須使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的交聯(lián)試劑，僅需使用便宜上千倍的普通交聯(lián)試劑。迄今，pLink在全球有800多個用戶，被眾多新開發(fā)者當(dāng)作CXMS軟件的業(yè)界標(biāo)桿來比較。

交聯(lián)質(zhì)譜讓結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究如虎添翼

質(zhì)譜研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法

在介紹交聯(lián)質(zhì)譜前，董夢秋為我們普及了用質(zhì)譜研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法。在當(dāng)今的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中，冷凍電鏡是主力。從單顆粒冷凍電鏡圖像中把形態(tài)相近的顆粒挑出來進行對齊、平均、三維重構(gòu)，可以得到高分辨度的電子密度圖，然后搭建蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)模型?？墒?，蛋白質(zhì)柔性區(qū)域的結(jié)構(gòu)無論用電鏡還是晶體學(xué)技術(shù)都很難看清楚，甚至完全不可見，這樣建模的時候會遇到斷頭路，往下接到哪兒是個問題。交聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)告訴我們，兩個被交聯(lián)的氨基酸殘基空間距離不會超過某個上限。有了足夠多的交聯(lián)距離約束信息后，我們就可以把斷頭路接起來，并推斷出柔性區(qū)的位置和分布方式。目前很多結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室在制備冷凍電鏡樣品時會分出一部分做交聯(lián)質(zhì)譜，后期匹配兩種數(shù)據(jù)以獲得更完整的結(jié)構(gòu)。而Native MS（非變性質(zhì)譜）可以提供蛋白質(zhì)復(fù)合體組成亞基的化學(xué)計量比，幫助搭建合理的結(jié)構(gòu)模型。Foot Printing（足跡法）用化學(xué)試劑標(biāo)記暴露在環(huán)境中的氨基酸殘基，酶解后可用質(zhì)譜檢測被修飾的肽段，從而了解哪些氨基酸分布在蛋白質(zhì)的外表面以及蛋白質(zhì)形成復(fù)合體后被包埋的區(qū)域。交聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的mono-link肽段（交聯(lián)劑一端與肽段共價連接，另一端水解而形成的修飾單肽）也可以提供同類信息。氫氘交換不受化學(xué)修飾試劑的選擇性限制，可以做得更精細。

交聯(lián)質(zhì)譜的基本原理

研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與相互作用的傳統(tǒng)技術(shù)，如核磁共振技術(shù)、X 射線晶體衍射技術(shù)等，對于蛋白質(zhì)的純度、結(jié)晶性和絕對量均有比較高的要求，限制了其廣泛應(yīng)用?；瘜W(xué)交聯(lián)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)(chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry)，簡稱交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、CXMS或XL-MS，是近年發(fā)展起來的新方法。它利用化學(xué)交聯(lián)劑 (chemical cross-linker) 處理蛋白質(zhì)樣品，將空間距離足夠接近、可以與交聯(lián)劑反應(yīng)的兩個氨基酸以共價鍵連接起來，然后利用基于高精度質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)手段分析交聯(lián)產(chǎn)物。交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在溶液態(tài)，反映了蛋白的溶液構(gòu)象。

交聯(lián)蛋白質(zhì)酶切后產(chǎn)生的交聯(lián)肽段的各種形式

交聯(lián)蛋白質(zhì)酶切后可以產(chǎn)生三種交聯(lián)產(chǎn)物（如上圖）：a．被交聯(lián)劑修飾的單肽 (交聯(lián)劑只一端交聯(lián)一條肽段，mono-linked peptide)，Type-0 類型的交聯(lián)肽段；b．肽段內(nèi)部交聯(lián) (交聯(lián)劑兩端交聯(lián)同一條肽段，loop-linked peptide 或intra-linked peptide)，Type-1類型的交聯(lián)肽段；c．肽段間交聯(lián) (交聯(lián)劑交聯(lián)兩條肽段，Inter-linked peptides)，Type-2 類型的交聯(lián)肽段。其中，最有用的是Type-2類型。

交聯(lián)質(zhì)譜的應(yīng)用實例

第一個例子，同UCLA一個實驗室合作研究mTORC1激酶復(fù)合體以何種方式募集底物蛋白4E-BP1（J Biol Chem. 2014 Feb 21.）。mTORC1激酶復(fù)合體由mTOR、Raptor和LST8三個蛋白組成。有人認為募集4E-BP1的是mTOR，也有人認為是Raptor。mTORC1與4E-BP1的交聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果表明只有Raptor N-端的第一個RNC結(jié)構(gòu)域同4E-BP1間有交聯(lián)。

用交聯(lián)質(zhì)譜揭示Raptor和4E-BP1的作用界面信息

依據(jù)交聯(lián)結(jié)果的距離約束信息構(gòu)建結(jié)構(gòu)模型，再用肽段競爭實驗進行生物學(xué)驗證，可以確認交聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果可靠，mTORC1復(fù)合體中的Raptor亞基招募了4E-BP1。 如上圖所示，Raptor兩個α-螺旋(α-helix) 形成的“基座”與4E-BP1肽段（紫色）結(jié)合

第二個例子，同NIBS一個遺傳學(xué)實驗室合作，研究裂殖酵母中兩個水解酶APE2和LAP2是如何通過一個叫NBR1的蛋白運送到溶酶體中的（Mol Cell. 2015 Sep 17.）。利用交聯(lián)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)APE2是關(guān)鍵，因為另外兩個蛋白都與它的N末端有交聯(lián)。去掉APE2 N端的5個氨基酸后再做實驗并用熒光標(biāo)記，證實了該結(jié)果。沒有這些N端的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點，就不能形成三元復(fù)合體，兩個水解酶都無法進入溶酶體中。

Nbr1、Ape2和Lap2的結(jié)合

在第三個例子中，交聯(lián)質(zhì)譜與冷凍電鏡技術(shù)結(jié)合，解析核糖體前體的組裝過程（Nature， 2016，細胞核內(nèi)的核糖體組裝前體結(jié)構(gòu)揭示了裝配成熟因子的功能多樣性），合作者是清華大學(xué)高寧教授。核糖體前體在加工過程中，有很多組裝因子（Assembly factor）蛋白參與，組裝任務(wù)完成后它們被去除。比如，有很多組裝因子結(jié)合在pre-60S核糖體前體的ITS2區(qū)域，但它們的結(jié)構(gòu)未知（不知道積木塊兒長什么樣），不能用搭積木的方法歸屬該區(qū)域的電子密度。通過二級結(jié)構(gòu)搜索，比如把電鏡看到的長長短短的α-螺旋與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的α-螺旋進行比對，找到部分肽段的位置，再加上交聯(lián)質(zhì)譜信息一點點推斷、確認，最后全部解析這部分結(jié)構(gòu)。

用冷凍電鏡+交聯(lián)質(zhì)譜揭示核糖體組裝前體結(jié)構(gòu)

第四個例子是同清華大學(xué)王宏偉教授的合作研究（J Mol Biol.， 2017）。WHAMM蛋白的作用是沿著微管鋪就的軌道運送囊泡（vesicle）。它一端結(jié)合囊泡，另一端結(jié)合微管。與微管結(jié)合后，WHAMM的微管結(jié)合域 (MTBD) 在冷凍電鏡中只能看到被稱為MBM（Microtube Binding Motif，圖中用紫色表示）的一小部分，它與微管緊密結(jié)合；其余部分（圖中用黃色表示）因為高度靈活（flexible），所以電鏡無法看清。通過交聯(lián)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)， MBM（紫色部分）在沒有結(jié)合微管時與MTBD的其它區(qū)域（黃色）有大量交聯(lián)，但結(jié)合了微管后就看不見了。該結(jié)果與冷凍電鏡結(jié)果互補，啟發(fā)我們得到一個合理的解釋，即MTBD結(jié)合微管前后發(fā)生了巨大的構(gòu)象變化，MBM與MTBD的其余部分原本緊挨著，一旦結(jié)合了微管兩邊就分開了，而且相互之間可以隨意擺動。

用交聯(lián)質(zhì)譜揭示W(wǎng)HAMM和微管結(jié)合的、冷凍電鏡看不清的Flexible區(qū)域

交聯(lián)質(zhì)譜還可以鑒定體內(nèi)天然發(fā)生的一些交聯(lián)，如二硫鍵。關(guān)注蛋白質(zhì)藥物研發(fā)的生物制藥公司有很多這方面的需求。交聯(lián)質(zhì)譜還可以表征蛋白質(zhì)動態(tài)。董夢秋實驗室與武漢物理與數(shù)學(xué)研究所唐淳實驗室合作在JBC發(fā)表題為“Modeling protein excited-state structures from "over-length" chemical cross-links”的研究論文，成功開發(fā)了基于交聯(lián)質(zhì)譜的研究蛋白質(zhì)動態(tài) (protein dynamics) 的新方法，并發(fā)布了通用流程。通過交聯(lián)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)計算發(fā)現(xiàn)，結(jié)合了鈣離子但沒有結(jié)合配體肽段或蛋白的鈣調(diào)蛋白（Ca2+-CaM） 除了采取啞鈴狀的開放態(tài)構(gòu)象（基態(tài)），還有一種閉合態(tài)構(gòu)象，非常接近之前用NMR手段觀察到的激發(fā)態(tài)構(gòu)象。(生物谷Bioon.com）

小編推薦會議  2019臨床質(zhì)譜與高端醫(yī)學(xué)檢驗發(fā)展論壇

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