質(zhì)譜技術(shù)是19世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一項(xiàng)劃時(shí)代技術(shù)，它通過(guò)測(cè)定物質(zhì)的分子量而為探索物質(zhì)的結(jié)構(gòu)提供了豐富的信息。而將分離技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合則是分離科學(xué)的一項(xiàng)突破性進(jìn)步。比如采用質(zhì)譜法作為氣相色譜(GC)的檢測(cè)器早已成為一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化的GC技術(shù)，但由于GC-MS不能分離不穩(wěn)定和不揮發(fā)的物質(zhì)，所以又逐漸發(fā)展出了液相色譜(LC)與質(zhì)譜連用的技術(shù)。到現(xiàn)在，無(wú)論是GC-MS，CE-MS(毛細(xì)管電泳)，還是LC-MS都已經(jīng)成為了分析化學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

與傳統(tǒng)的分析化學(xué)領(lǐng)域不同，能夠應(yīng)用于臨床檢測(cè)領(lǐng)域的技術(shù)不僅要能夠滿足對(duì)物質(zhì)檢測(cè)特異性的要求，還要能夠滿足臨床檢驗(yàn)對(duì)于準(zhǔn)確性、重復(fù)性和線性度等要求。因此，任何一項(xiàng)能夠被國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的臨床檢測(cè)，都不僅僅是一項(xiàng)技術(shù)的革新，而更是一整套具有完備技術(shù)說(shuō)明、工作流程和數(shù)據(jù)規(guī)范的工作系統(tǒng)。

在我國(guó)，截止到2016年4月30日，CFDA總共批準(zhǔn)了與質(zhì)譜技術(shù)相關(guān)的進(jìn)口器械12項(xiàng)，國(guó)產(chǎn)器械8項(xiàng)。這一數(shù)量與諸如生化、免疫、化學(xué)發(fā)光等技術(shù)的大量批件相比實(shí)在比例甚微，說(shuō)明在這一方面在未來(lái)會(huì)有非常大的增長(zhǎng)空間。

在目前獲批的質(zhì)譜技術(shù)相關(guān)批件中，主要分為兩大類。一類是針對(duì)于小分子代謝物的檢測(cè)，比如應(yīng)用于新生兒代謝病篩查的丙氨酸、甘氨酸、25-羥基維生素D，以及同型半胱氨酸等的LC-MS、LC-MS/MS方法；另一類是采用MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于大分子(蛋白質(zhì))進(jìn)行檢測(cè)的質(zhì)譜技術(shù)，這一技術(shù)目前主要應(yīng)用于對(duì)微生物的鑒定。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，不僅僅是針對(duì)于基因水平的研究越來(lái)越深入，針對(duì)于蛋白的研究也正在不斷的與臨床檢測(cè)具有越來(lái)越多的結(jié)合。除了現(xiàn)有的ELISA，免疫和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，基于質(zhì)譜的技術(shù)在不久的將來(lái)一定會(huì)在蛋白質(zhì)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)領(lǐng)域成為對(duì)蛋白進(jìn)行定量和監(jiān)測(cè)的最重要技術(shù)，而將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)領(lǐng)域也將是下一個(gè)十年的檢驗(yàn)領(lǐng)域的大事件。為此，美國(guó)FDA于5月初舉辦了一次大型的政府-高校-廠家的多方會(huì)談，旨在從監(jiān)管-學(xué)術(shù)-生產(chǎn)等多個(gè)角度對(duì)LC-MS技術(shù)在臨床應(yīng)用中的現(xiàn)狀、可能碰到的問(wèn)題以及如何對(duì)其進(jìn)行監(jiān)管等進(jìn)行了深入討論。下文將對(duì)此會(huì)議內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)述，為國(guó)內(nèi)相關(guān)研究機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)以及政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供最新進(jìn)展。

即使在美國(guó)，LC-MS在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用也僅處于起始階段。根據(jù)華盛頓大學(xué)教授Andy Hoofnagle提供的數(shù)據(jù)，在全美7700家獲得CAP認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室中，采用LC-MS技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室大約只有不超過(guò)200家，比例不超過(guò)總實(shí)驗(yàn)室數(shù)量的2.6%。

LC-MS技術(shù)是否能夠與其他技術(shù)一樣，在臨床應(yīng)用中得到認(rèn)可，我們可以從某一項(xiàng)具體的檢測(cè)項(xiàng)目中稍作了解。以25-羥基維生素D為例，可進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)的方法和儀器都有很多種，所以可以從CAP的能力驗(yàn)證測(cè)試結(jié)果對(duì)LC-MS的檢測(cè)能力進(jìn)行了解。

從以上結(jié)果可以看出，LC-MS技術(shù)可以滿足能力驗(yàn)證的要求，是可以應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的。

作為全球最先進(jìn)的藥物監(jiān)管單位，FDA在此次會(huì)談中也派出了多名官員，從產(chǎn)品分類、注冊(cè)流程、技術(shù)參數(shù)等方面對(duì)LC-MS的臨床注冊(cè)工作進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。

在美國(guó)，早在1976年的醫(yī)療器械修正案就要求所有醫(yī)療器械必須合法進(jìn)入市場(chǎng)，因此1976年之后的所有醫(yī)療器械必須全部經(jīng)過(guò)FDA審批，才能進(jìn)入市場(chǎng)。

至于大家最耳熟能詳?shù)?a class="channel_keylink" target="_blank">體外診斷試劑相關(guān)產(chǎn)品(In Vitro Diagnostics，IVD)，根據(jù)美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)21 CFR 809.3條款，可理解為是醫(yī)療器械的一個(gè)亞類，其是旨在用于診斷疾病或其他不適的試劑，儀器和系統(tǒng)，包括對(duì)于健康狀態(tài)的判讀，從而用來(lái)治愈、緩解、治療或預(yù)防疾病或其后遺癥。FDA根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)，將醫(yī)療器械分為三類，第一類為低風(fēng)險(xiǎn)，一般性控制就可以；第二類為中度風(fēng)險(xiǎn)，一般性控制通常還不足夠，往往需要進(jìn)行特殊控制；第三類為高風(fēng)險(xiǎn)，可對(duì)患者或使用者造成過(guò)度的傷害或疾病風(fēng)險(xiǎn)，以及對(duì)生命維持系統(tǒng)和人類健康造成重大損傷。目前要通過(guò)FDA批準(zhǔn)才能進(jìn)入市場(chǎng)主要有三種方式，第一種是上市前通告，也就是常說(shuō)的510(k)，另一種是重新審批De novo，還有一種是上市前申請(qǐng)PMA(Pre-Market application)。

510(k)包括部分I類產(chǎn)品(絕大多數(shù)還可以豁免)以及大部分的II類產(chǎn)品(極少數(shù)能豁免)，F(xiàn)DA根據(jù)其是否與之前的上市產(chǎn)品具有“實(shí)質(zhì)性等同”來(lái)進(jìn)行許可，目前，進(jìn)行此類申請(qǐng)需要先找到一個(gè)與申請(qǐng)標(biāo)的類似的產(chǎn)品(包括計(jì)算參數(shù))并有類似的預(yù)期使用范圍(即，前置產(chǎn)品Predicate)。FDA需要90天來(lái)給出答復(fù)。最終的決定書概要會(huì)公布在官網(wǎng)上。

De novo類別是針對(duì)目前市場(chǎng)上還沒(méi)有前置產(chǎn)品的低風(fēng)險(xiǎn)到中等風(fēng)險(xiǎn)設(shè)備。根據(jù)具體情況進(jìn)行I類或II類的劃分，需要120天給出答復(fù)，De novo產(chǎn)品會(huì)成為以后具有相同預(yù)期用途產(chǎn)品類型的前置產(chǎn)品。

PMA類別是針對(duì)于III類產(chǎn)品的，其不需要前置產(chǎn)品，需要證明其安全性和有效性，可以要求在進(jìn)行批準(zhǔn)前征求顧問(wèn)委員會(huì)的決定，其安全性和有效性數(shù)據(jù)(SSED)會(huì)在官網(wǎng)上公開(kāi)，需要180天給出答復(fù)。

從FDA的角度出發(fā)，其職能在于要確保醫(yī)療器械、包括IVD產(chǎn)品，能夠合理地安全且有效地實(shí)現(xiàn)其預(yù)期使用目的。所以，對(duì)其進(jìn)行分析性驗(yàn)證是實(shí)現(xiàn)注冊(cè)審批的第一步。具體到LC-MS相關(guān)設(shè)備及IVD產(chǎn)品時(shí)，則主要包括以下關(guān)鍵內(nèi)容：(1)需要明確闡述何種被檢物是通過(guò)IVD進(jìn)行度量或檢測(cè)的，(2)需要進(jìn)行IVD檢測(cè)的樣品或樣本類型，(3)所申報(bào)IVD產(chǎn)品的底層技術(shù)，(4)所實(shí)施檢測(cè)的類型(定量檢測(cè)、定型檢測(cè)、半定量檢測(cè)等)，(5)適用于所申報(bào)測(cè)試的患者人群，(6)檢測(cè)結(jié)果的臨床目的，包括所提供設(shè)備能夠檢測(cè)的疾病/不適(比如，可輔助于(某種疾病/不適)的診斷)，(7)所實(shí)施檢測(cè)的參數(shù)設(shè)置，以及(8)最有可能獲得檢測(cè)結(jié)果的參數(shù)設(shè)置。

分管醫(yī)療器械審批的具體部門CDRH(Center for Devices and Radiological Health)，及其下屬分支中最重要的兩個(gè)辦公室ODE(Office of Device Evaluation)和OIR(Office of In Vitro Diagnostics and Radiological Health)在本次會(huì)談中特別指出，建議各申報(bào)單位在進(jìn)行涉及基于蛋白和多肽的LC-MS相關(guān)產(chǎn)品申報(bào)之前，最好先提交一份預(yù)申報(bào)申請(qǐng)，從而能夠與FDA進(jìn)行關(guān)于充分交流，以免在開(kāi)始審批程序之后再對(duì)相關(guān)申報(bào)方案進(jìn)行修改。這些建議的具體內(nèi)容，包括，但不限于：

1.準(zhǔn)確度和重復(fù)性

就LC-MS相關(guān)產(chǎn)品而言，因?yàn)槠渖婕暗墓ぷ髁鞒掏ǔ１容^復(fù)雜，所以必須特別加以重視。需要考慮到的步驟包括了從樣品收集直到最終的數(shù)據(jù)輸出和分析，以及其中的某些特殊環(huán)節(jié)。

考慮到質(zhì)譜技術(shù)可以一次對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，因此，從一次質(zhì)譜測(cè)量得到的針對(duì)于多個(gè)被檢物的分析結(jié)果，可以被用作多重分析或可將其組合成為一個(gè)可接受的結(jié)果。但是，如果是多重分析，則要求所有被檢物都需要在一個(gè)測(cè)試中被全部檢測(cè)出來(lái)，而且每一種被檢物都要被單獨(dú)進(jìn)行評(píng)價(jià)和報(bào)告。例如，來(lái)自于患者樣本中的一種或多種蛋白，即若干的不同被檢物，可作為單獨(dú)因素合并于某一算法中，從而提供一個(gè)最終的、可接受的結(jié)果，例如預(yù)測(cè)某種疾病風(fēng)險(xiǎn)的分?jǐn)?shù)。而FDA通常會(huì)需要申請(qǐng)人提供證據(jù)，說(shuō)明每一種被檢物對(duì)于最終分?jǐn)?shù)的貢獻(xiàn)，以及每一種組分在各種濃度組合中對(duì)于最終分?jǐn)?shù)的貢獻(xiàn)。

2.線形度和回收率

對(duì)于測(cè)量多種被檢物L(fēng)C-MS相關(guān)產(chǎn)品而言，無(wú)論是單獨(dú)(通過(guò)多種不同的樣板，每次測(cè)量一個(gè))或者組合(以IVDMIA方式)進(jìn)行測(cè)量，申請(qǐng)人都需要對(duì)每一種被檢物(獨(dú)立于其它被檢物)進(jìn)行線形度和回收率的評(píng)估。

3.樣本的結(jié)轉(zhuǎn)

根據(jù)某項(xiàng)分析的工作流程不同，有可能存在前序樣本中含有新的樣本，而對(duì)申請(qǐng)人而言，則需要對(duì)所述工作流程中有可能產(chǎn)生結(jié)轉(zhuǎn)的每一步驟都進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)。在FDA之前的受理過(guò)程中，的確接到過(guò)這樣的結(jié)轉(zhuǎn)研究，即在包括所述設(shè)備的一系列全部工作流程中，在陰性或弱陽(yáng)性樣本中出現(xiàn)了強(qiáng)陽(yáng)性的情況。

4.檢測(cè)限/分析靈敏度：空白限、檢測(cè)限和定量限

LC-MS相關(guān)產(chǎn)品依賴于質(zhì)譜儀對(duì)于峰值的檢測(cè)與定量，或液相色譜中隨洗脫時(shí)間對(duì)離子流的測(cè)量。這兩種測(cè)量都離不開(kāi)對(duì)高于系統(tǒng)中化學(xué)與電子噪聲的峰的檢測(cè)。在實(shí)際情況中，由于缺乏可靠的空白樣本，以及LC-MS技術(shù)的較低背景噪聲，要想確定空白限(LoB，limit of blank)往往是很難實(shí)現(xiàn)的；然而，如果某些臨床檢測(cè)的判定點(diǎn)接近于一起的靈敏度極限時(shí)，LoB就顯得至關(guān)重要了。LC-MS產(chǎn)品的檢測(cè)限(LoD，limit of detection)是采用信噪比的低值計(jì)算出來(lái)的。在不同的設(shè)備中，信噪比往往是不一樣的。

5.分析特異性與干擾

對(duì)LC-MS產(chǎn)品而言，主要有兩類干擾物會(huì)影響對(duì)被檢物的測(cè)量與定量。一類是存在于樣本中的同重離子或近同重離子(isobaric or near isobaric ions)，此類離子能夠在質(zhì)譜儀中被同時(shí)檢測(cè)到，從

而對(duì)正確離子的檢測(cè)和定量造成干擾。因此有必要對(duì)這些干擾物的存在與否進(jìn)行評(píng)估，從而闡明是否這些干擾物的存在會(huì)影響到所述設(shè)備的安全性和有效性，還需要考慮到在標(biāo)準(zhǔn)操作條件下質(zhì)譜儀的分子量分辨率。

6.樣品制備

對(duì)于LC-MS相關(guān)設(shè)備而言，其樣品制備、尤其是涉及到蛋白和多肽的樣品制備是非常復(fù)雜的，也是在相關(guān)分析檢測(cè)中產(chǎn)生不精確和不可重復(fù)性的主要原因。因此，對(duì)操作人員、儀器、地點(diǎn)等各種變量進(jìn)行控制的能力，都會(huì)對(duì)LC-MS產(chǎn)品的安全性和有效性提出挑戰(zhàn)。

7.內(nèi)標(biāo)

對(duì)那些需要進(jìn)行大量樣品制備的LC-MS相關(guān)產(chǎn)品而言，內(nèi)標(biāo)的加入可以在整個(gè)工作流程中對(duì)不同步驟進(jìn)行監(jiān)控，從而了解被檢物的鑒定和定量信息。一般而言，內(nèi)標(biāo)的加入時(shí)間在整個(gè)分析流程中越早越好。內(nèi)標(biāo)的加入還可以實(shí)現(xiàn)在不同樣本、校準(zhǔn)品和對(duì)照品中對(duì)被檢物值進(jìn)行規(guī)范化。

8.校準(zhǔn)品和對(duì)照品

校準(zhǔn)品是用來(lái)將設(shè)備的原始輸出值轉(zhuǎn)化成被檢物濃度的參考，這樣的濃度可用于形成具有臨床判斷價(jià)值的數(shù)據(jù)。除了已知濃度的被檢物之外，對(duì)照品通常需要含有固定數(shù)量的內(nèi)標(biāo)，從而能夠在校準(zhǔn)品和患者樣本之間提供相對(duì)定量。在本文中，對(duì)照品是指對(duì)整個(gè)體系表現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證的材料，即陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。這樣的對(duì)照品并非是用于LC-MS相關(guān)產(chǎn)品流程控制中的標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)。

9.對(duì)比方法

通常，F(xiàn)DA都會(huì)以WHO和/或NIBSC的方法作為某一具體被檢物的“金標(biāo)準(zhǔn)”。標(biāo)準(zhǔn)參考方法也通常是指為了獲知目標(biāo)條件有無(wú)二采用的最易獲得的方法。很多時(shí)候，在針對(duì)同一種被檢物的時(shí)候，可以有很多種不同的檢測(cè)方法，當(dāng)某一方法具有與提交申請(qǐng)具有相同的預(yù)期使用目的時(shí)，通常被稱為前置方法(Predicate)?？紤]到LC-MS設(shè)備的輸出結(jié)果與大多數(shù)儀器，例如免疫分析的輸出結(jié)果不同，因此要想直接對(duì)兩種儀器進(jìn)行比較是很困難的。要解決這一難題，且目前還沒(méi)有金標(biāo)準(zhǔn)或者參考方法的情況下，FDA也可以考慮接受經(jīng)由與臨床“真實(shí)”(即，根據(jù)目前的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)某一患者狀態(tài)的臨床全面評(píng)估)的儀器性能進(jìn)行過(guò)對(duì)比和證實(shí)的申請(qǐng)。

10.蛋白/多肽的選擇

除了少數(shù)不需要經(jīng)過(guò)蛋白裂解就能夠被輕易檢測(cè)到的小分子生物活性多肽之外，絕大多數(shù)的多肽都是作為完整蛋白的代表。申請(qǐng)人可自行選擇最適合于其申報(bào)檢測(cè)項(xiàng)目的多肽，當(dāng)然這些多肽的生物物理性質(zhì)會(huì)影響其檢測(cè)項(xiàng)目的表現(xiàn)，包括體內(nèi)或在工作流程中對(duì)于翻譯后修飾的敏感性，胰酶水解的速率和效率，多肽在樣本和工作流程中的穩(wěn)定性等等。

11.峰選擇

峰的選擇與評(píng)價(jià)對(duì)LC-MS產(chǎn)品的表現(xiàn)而言至關(guān)重要。影響液相色譜洗脫峰分辨率和重復(fù)性的因素包括色譜柱的選擇，緩沖液，流速和溫度等等。FDA之前就曾要求過(guò)申請(qǐng)人提交相關(guān)數(shù)據(jù)，證明在臨床實(shí)驗(yàn)室可能碰到的各種操作條件下，色譜峰的分辨率和重復(fù)性可以滿足審批要求。即使目前缺乏某些內(nèi)標(biāo)，FDA也可要求申請(qǐng)人提供數(shù)據(jù)，確保正確的峰和離子可以被檢測(cè)和定量。

對(duì)挑選色譜峰的軟件進(jìn)行選擇和評(píng)價(jià)也十分關(guān)鍵，尤其是在那些被檢物接近于最低定量限的樣本中，申請(qǐng)人需要對(duì)選峰軟件的準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估，并理解其重要性。

12.核心IVD組件

對(duì)LC-MS相關(guān)的產(chǎn)品而言，有很多耗材和組件都是必須的，例如色譜柱，胰酶的來(lái)源和類型，免疫親和抗體，免疫耗竭柱等。根據(jù)FDA之前的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)核心組件中的任意一種進(jìn)行更換，都會(huì)導(dǎo)致分析過(guò)程中某種成分的改變，甚至需要對(duì)整個(gè)分析過(guò)程進(jìn)行重新驗(yàn)證。(生物谷Bioon.com）

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