細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由細(xì)胞分泌的具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的囊泡小體，絕大多數(shù)細(xì)胞均可分泌。細(xì)胞外囊泡中可以攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多種生物活性成份，介導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞間遠(yuǎn)程通訊【1】。根據(jù)大小分類，EVs可以分為直徑小于200納米的sEVs(small extracellular vesicles)和直徑大于200納米的lEVs(Large extracellular vesicles)。根據(jù)其來源分類，細(xì)胞外囊泡主要可以分為來源于多囊泡體(multivesicular endosomes，MVEs)的外泌體(Exosomes，30-50 nm)和來源于細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane)的微體(Microvesicles，100-1000 nm)【2】。

隨著外泌體的研究的增加，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，在外泌體樣品(“exosomal” samples)中不僅僅包含sEVs，同時(shí)還會混雜著“不含膜性結(jié)構(gòu)”的NV組分(non-vesicular compartments)。而NV組分帶來的異質(zhì)性往往會對外泌體組成成分及功能的研究產(chǎn)生干擾和混淆。目前，分離純化細(xì)胞外囊泡的方法主要有四類，即超高速離心法、過濾法、沉淀法和免疫富集法。這些分離方法沒有明確的將sEVs與NV組分分開，因此可能會對后續(xù)的分析產(chǎn)生干擾。同時(shí)，目前鑒定出來可以作為外泌體標(biāo)記物的經(jīng)典分子有CD63、CD81和CD9【3】，然而還沒有發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步區(qū)別微體和外泌體的特異標(biāo)記物。

2019年4月4日，來自美國范德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Robert J. Coffey課題組在Cell發(fā)表題為Reassessment of Exosome Composition的研究，研究人員通過高分辨率密度梯度離心結(jié)合免疫親和捕獲的技術(shù)將外泌體從NV組分中分離，并發(fā)現(xiàn)Ago1-4以及MVP蛋白的分泌不依賴于外泌體，并且Annexin A1可以做為來源于細(xì)胞膜的微體的標(biāo)記物以區(qū)別于來源于內(nèi)體的外泌體。同時(shí)，細(xì)胞外DNA的分泌并不依賴于外泌體，而是依賴于內(nèi)吞自噬融合體介導(dǎo)的途徑。

首先，研究人員使用傳統(tǒng)的差速離心的方法分離了DKO-1細(xì)胞系和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Gli36)的lEVs(P15)和sEVs(P120)，再通過高分辨率密度梯度離心(High-Resolution Density Gradient Fractionation)進(jìn)一步分離得到的包含有sEVs的P120組分。通過檢測CD63和CD81表明，該實(shí)驗(yàn)采用的高分辨率密度梯度離心可以很好的將sEVs和NV組分分離。

接下來，研究人員通過液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)以及RNA-seq技術(shù)分別分析sEVs和NV組分中的蛋白和細(xì)胞外RNA成分，發(fā)現(xiàn)之前認(rèn)為很多存在于外泌體組分中的蛋白及RNA其實(shí)更多的存在于NV組分中。

在RNA結(jié)合蛋白方面，研究人員通過“直接”免疫親和捕獲技術(shù)(Direct Immunoaffinity Capture，DIC)發(fā)現(xiàn)，包括miRNA結(jié)合蛋白Ago1-4以及hnRNPA2B1、GAPDH和穹窿體主蛋白(major vault protein，MVP)等的分泌并不依賴于外泌體。同時(shí)，包括丙酮酸激酶(pyruvate kinase M1/2，PKM)在內(nèi)的糖酵解酶和細(xì)胞骨架蛋白以及與外泌體生成有關(guān)的RAB GTPase等也不在外泌體組分中。

在膜結(jié)合蛋白方面，研究人員通過改變密度梯度離心的組分并且結(jié)合SIM(Structured illumination microscopy)成像，發(fā)現(xiàn)Annexin A1和A2標(biāo)記的EVs能夠很好的區(qū)分于經(jīng)典的外泌體，同時(shí)Annexin A1能夠作為來自細(xì)胞質(zhì)膜的微體的標(biāo)記物。

在之前的研究中，外泌體被報(bào)道含有雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)以及組蛋白【4-5】。然而，在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA和組蛋白更多的位于NV組分中，而不是外泌體或者sEVs中。進(jìn)一步通過SIM成像，研究人員發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA和組蛋白定位于CD63和LC3B陽性的內(nèi)吞自噬融合體(amphisomes)中，并且能夠出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)膜的部位。因此，研究人員提出DNA分泌是依賴于自噬和多泡內(nèi)體，而不依賴于外泌體。

總之，該研究通過高分辨密度梯度離心以及“直接”免疫親和捕獲兩種技術(shù)手段的結(jié)合，將sEVs與細(xì)胞外NV組分分開，從而更精確地鑒定了以CD63、CD81和CD9為標(biāo)記物的經(jīng)典外泌體中的蛋白和RNA等分子組分，為細(xì)胞外囊泡的異質(zhì)性提供了更深入的認(rèn)識，同時(shí)為將來通過細(xì)胞外囊泡進(jìn)行疾病診斷和治療提供了重要的幫助。(生物谷Bioon.com）

小編推薦會議  2019（第四屆）外泌體與疾病研討會

http://meeting.bioon.com/2019Exosomes?__token=liaodefeng