膽管癌（CCA）是惡性度較高的消化系統(tǒng)腫瘤。因其發(fā)展隱蔽且臨床癥狀及體征出現(xiàn)晚，故給早期診斷帶來困難。原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）是導(dǎo)致膽管癌的主要原因之一。在非侵染時(shí)期，鑒定肝內(nèi)的膽管癌及肝癌（HCC）是非常困難的。目前尚未有準(zhǔn)確區(qū)分CCA，PSC，及HCC的生物標(biāo)記物。

為了尋找新的生物標(biāo)志物，來自西班牙的研究者，利用高效的外泌體分離方法，分別從CCA、PSC，和HCC患者的血清樣本中分離得到外泌體，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從中篩選出新的生物標(biāo)記物，具有作為臨床診斷工具的潛在應(yīng)用價(jià)值，研究結(jié)果發(fā)表在國際著名期刊Hepatology上。

關(guān)鍵詞：膽管癌，膽管炎，肝癌，biomarker，診斷

2研究思路

3研究速讀

1、血清EV樣本的選擇、分離與鑒定

為了研究三者之間的區(qū)別，研究者選擇了43例膽管癌，30例膽管炎，29例肝癌患者與32例正常人的血清樣本，從中分離出細(xì)胞外囊泡(EV)作為研究對(duì)象。

通過使用納米粒子跟蹤分析（NTA）、圓形形態(tài)（透射電子顯微鏡）、大?。∟TA為？180nm直徑）和標(biāo)記物（免疫印跡檢測CD9、CD63和CD81）表明，大多數(shù)血清EV是外泌體。

2、外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定樣本間差異

研究者運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定病理樣本中的差異表達(dá)蛋白，在健康人外泌體鑒定到541個(gè)蛋白，膽管炎外泌體鑒定到427個(gè)蛋白，膽管癌外泌體鑒定到574個(gè)蛋白，肝癌樣本中鑒定到399個(gè)蛋白，然后對(duì)這些蛋白進(jìn)行韋恩圖分析，并且進(jìn)行兩兩比較（圖1）。

通過分析發(fā)現(xiàn)膽管癌中VNN1， CRP（C-reactive protein）， FIBG， IGHA1， A1AG1 and GGT1 這6個(gè)蛋白的表達(dá)量顯著高于其他的三個(gè)樣本，免疫印跡驗(yàn)證表明膽管癌樣本中CRP顯著性高表達(dá)，說明CRP蛋白顯示出較高的診斷價(jià)值。

3、比較正常細(xì)胞和CCA細(xì)胞分泌的EV中蛋白組成差異

為了研究膽管癌細(xì)胞與正常細(xì)胞間的差異，研究者培養(yǎng)正常的膽管細(xì)胞、SV40侵染的無限增殖H69細(xì)胞與兩種商品化的膽管癌細(xì)胞EGI1 、TFK1，分離出細(xì)胞外泌體，并對(duì)其形態(tài)及抗原特征進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，4種樣本的外泌體在形態(tài)及大小上沒有顯著的區(qū)別，免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)兩種膽管癌腫瘤細(xì)胞中CD63的量顯著的高于正常細(xì)胞。

然后作者進(jìn)一步的對(duì)四種樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)兩種腫瘤細(xì)胞的蛋白差異不顯著，與H69細(xì)胞和正常細(xì)胞均存在有顯著性的差異，并且H69細(xì)胞蛋白比正常細(xì)胞更接近于腫瘤細(xì)胞。對(duì)差異蛋白的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多部分差異蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與細(xì)胞增殖，炎癥，細(xì)胞生存，分化，遷移等生物學(xué)功能。

4、異種移植CCA，證實(shí)含有差異蛋白的外泌體能夠在血清中釋放

最后研究者在免疫缺陷小鼠的肝臟中原位植入人CCA細(xì)胞，證實(shí)了膽管癌CCA細(xì)胞外泌體中的差異蛋白能夠在血液中鑒定到。為此研究者將膽管癌細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析小鼠血液外泌體，從中鑒定到23個(gè)人類的蛋白，證明腫瘤的外泌體可以分泌到血液中。說明血清EV中發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質(zhì)組學(xué)特征，具有作為診斷工具的潛在應(yīng)用價(jià)值。

4小結(jié)

本研究通過對(duì)比膽管癌（CCA），原發(fā)性硬化膽管炎（PSC），及肝癌（HCC）的血清外泌體的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)樣本間的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。通過對(duì)人膽管癌細(xì)胞EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，與正常人膽管細(xì)胞釋放的EV相比，其致癌蛋白的豐度更高。在免疫缺陷小鼠的肝臟中原位植入人CCA細(xì)胞，導(dǎo)致含有類似人致癌蛋白的EV在血清中釋放。在CCA、PSC和HCC患者的血清EV中發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，具有作為診斷工具的潛在應(yīng)用價(jià)值。(世聯(lián)博研(Bioexcellence)bioon.com）

小編推薦會(huì)議  2019（第四屆）外泌體與疾病研討會(huì)

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