從2016年FDA批準首個基于EGFR基因突變的液體活檢產(chǎn)品，到今年8月bTMB被證實可以預(yù)測免疫治療的效果，液體活檢已在腫瘤治療領(lǐng)域大放異彩。

不幸的是，血液中的腫瘤循環(huán)DNA分子含量通常遠遠低于血液中非癌癥相關(guān)DNA的片段，這使得檢測它們非常困難，特別是在癌癥的早期階段。

今天，英國劍橋大學(xué)科學(xué)家Nitzan Rosenfeld帶領(lǐng)的團隊，終于為液體活檢打開了封印。他們發(fā)現(xiàn)了血液中循環(huán)腫瘤DNA和非腫瘤DNA片段的長度分布特征。找到了一種更靈敏的血液中腫瘤DNA檢測方法。

研究者們在體外富集血漿中特定片段長度的游離DNA（cfDNA），然后測序，發(fā)現(xiàn)用測序結(jié)果區(qū)分腫瘤血液樣本和健康血液樣本時，曲線下面積超過0.99，而未富集的普通cfDNA檢測只有不到0.8。此外，這種富集的方法可以使液體活檢在更早期就能檢測到癌癥。這項研究發(fā)表在最新一期的著名學(xué)術(shù)期刊Science Translational Medicine 上[1]。

前排中間為Nitzan Rosenfeld博士

血漿中存在著很多游離的DNA（cfDNA），包括腫瘤來源的（ctDNA），以及非腫瘤來源的。非腫瘤來源的DNA占了cfDNA的絕大部分，使得ctDNA的豐度很低[2]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)ctDNA在cfDNA中的豐度在10%或以上時，才能得到準確的腫瘤信息[3]。但是，除了某些晚期的腫瘤會釋放大量ctDNA外，大多數(shù)腫瘤患者的ctDNA的豐度達不到這個標(biāo)準[4]。

目前，主要是通過加大測序深度來提高ctDNA檢測的靈敏度和準確率，但是加大測序深度可能會帶來假陽性的結(jié)果，因為非腫瘤來源的DNA中也可能帶有各種腫瘤相關(guān)的突變[5]。這些問題一直限制著液體活檢的應(yīng)用。

不過，科學(xué)家的另一個發(fā)現(xiàn)卻可能解決這個問題。之前有研究表明，不同細胞釋放到血液中的cfDNA的長度會有所不同，例如，很多cfDNA的長度都是167bp（與一個核小體的DNA長度類似），這可能與細胞凋亡過程中半胱天冬酶依賴的DNA裂解相關(guān)[6]。

嬰兒的cfDNA就明顯比母親的cfDNA片段短，這個特點被運用與產(chǎn)前診斷[7]。這些研究說明不同細胞來源的cfDNA在長度上會呈現(xiàn)獨特的模式，可能可以作為區(qū)分cfDNA來源的信號。

這種cfDNA片段長度的差異很可能就存在于腫瘤細胞與非腫瘤細胞之中。這是一個絕妙的假設(shè)，如果這個假設(shè)成立，就可能解決腫瘤液體活檢面臨的困境。

不過，之前少數(shù)幾個在此方面的研究卻得出了相互沖突的結(jié)果，使得這方面的研究裹足不前。他們的問題主要在于不了解造成這種生物學(xué)差異的原因[8]。也即，不知道腫瘤細胞的DNA長度為什么會不同，使DNA片段的長度特征信號無法準確地代替腫瘤cfDNA。

Nitzan Rosenfeld博士接過了這個研究的大旗。他們猜測之前研究者失敗的原因，可能是得到的ctDNA片段的長度特征信號不夠靈敏。

于是，Rosenfeld博士帶領(lǐng)的研究者們設(shè)計新的方案進行了研究。他們從200個癌癥病人中收集了344份血漿樣本（包括18種不同類型的癌癥），然后取了65個健康人的血漿樣本作為對照。提取這些血漿樣本中的cfDNA后，分析發(fā)現(xiàn)健康人與癌癥患者的cfDNA在90 - 150 bp、180 - 220 bp和250 - 320 bp之間的分布都有所不同。

當(dāng)他們將這些cfDNA測序后發(fā)現(xiàn)了令人驚訝的結(jié)果，帶有癌癥突變的ctDNA片段普遍比核小體DNA片段（167bp）短20-40bp，在90-150bp區(qū)間富集，還有些在250-320bp之間富集（這可能是腫瘤細胞的雙核小體片段）。

帶腫瘤突變的片段在一個區(qū)間富集

以上結(jié)果可能預(yù)示著ctDNA在90-150bp區(qū)間的豐度可能會很高。研究者們在一種硅芯片上將cfDNA在按片段長度進行分離，通過測序發(fā)現(xiàn)在90-150bp區(qū)間中，ctDNA的豐度明顯提高。這說明可以通過富集短片段的方法提高ctDNA的豐度，進而能提高檢測的靈敏度和準確性。

于是，研究者們先用這種片段選擇性測序的方法檢測癌癥病人的腫瘤進展，發(fā)現(xiàn)比CT成像提前了60天檢測了腫瘤進展，而比未經(jīng)過片段選擇性的液體活檢提前了89天。片段選擇性測序顯示了無與倫比的優(yōu)勢！

新方法的優(yōu)勢還不止于此，研究人員取了一個隊列研究中48份腫瘤患者的血漿樣品，分別通過cfDNA片段選擇性測序和普通cfDNA測序，與已知結(jié)果相比，兩者的準確率分別是82%和50%。片段選擇性測序?qū)蚀_率的提升幅度異常明顯。

但是，科學(xué)家對這個結(jié)果還不是很滿意，覺得它還有提升的空間。因為其他長度的片段上也存在腫瘤突變，而只取90-150bp的片段會丟失一些信息。這種粗獷劃分顯然不能代表現(xiàn)代科學(xué)的水平。

接著，研究者們將各個長度區(qū)間的片段，包括P（20 to 150），P（100 to 150），P（160 to 180）， P（180 to 220），以及 P（250 to 320），都進行了分析，結(jié)合已知的突變位點，通過機器學(xué)習(xí)算法去尋找更加精細的規(guī)律，得到了一個人工智能模型。用這個模型在區(qū)分腫瘤血液樣本和健康血液樣本時，曲線下面積達到0.994，相當(dāng)令人震撼！

片段特異性測序顯示了完美的準確率

當(dāng)然，作者表示他們的方法還有一定局限性，那就是他們在體外對不同片段長度的DNA進行分離的方法，會造成一定偏差。可能不能準確反應(yīng)小于100bp和大于300bp長度的ctDNA。

盡管如此，從已達到的效果來看，這個通過片段特異富集進行液體活檢的方法，可以更早更靈敏地檢測腫瘤，這對于腫瘤的治療有重要意義！

本文第一作者Moulier說道，理論上這項新技術(shù)可以用于檢測所有類型的腫瘤。并且，這種技術(shù)對很多實驗室來說都很簡單，這意味著在不久的將來，它就能對公眾開放[9]。(生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）

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