Science：重大進(jìn)展！RNA疫苗讓claudin-CAR-T細(xì)胞更有效地抵抗實(shí)體瘤

利用經(jīng)過基因改造后表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）的T細(xì)胞（CAR-T）進(jìn)行過繼性T細(xì)胞治療已在B細(xì)胞惡性腫瘤中取得了臨床成功。然而，在實(shí)體瘤患者中，CAR-T細(xì)胞療法遭遇挑戰(zhàn)，并不那么有效。一個關(guān)鍵的障礙是允許高效根除腫瘤的癌癥特異性高表達(dá)和較低脫靶毒性（off-tumor/on-target toxicity ）風(fēng)險的細(xì)胞表面靶標(biāo)在數(shù)量上的有限性。

科學(xué)家們近期已報道了緊密連接蛋白6（claudin 6, CLDN6）的癌癥相關(guān)表達(dá)。CLDN6是一種參與緊密連接（tight junction）形成的四跨膜蛋白。 在一項(xiàng)新的研究中，為了評估CLDN6是否可作為CAR-T細(xì)胞療法的靶標(biāo)，來自德國生物制藥新技術(shù)公司（Biopharmaceutical New Technologies Corporation, BioNTech）的研究人員在一套完整的人類和小鼠組織中分析了它的表達(dá)。分析結(jié)果表明在人類中，CLDN6轉(zhuǎn)錄本水平在胎兒胃部、肺部和腎臟組織中較高，但在正常的成年人組織樣本中檢測不到。此外，與之前相一致的是，CLDN6轉(zhuǎn)錄本水平在諸如睪丸癌、卵巢癌、宮頸腺癌和肺腺癌之類的多種人類癌癥中通常較高。而在小鼠中，CLDN6在胎兒器官中廣泛表達(dá)，但在產(chǎn)前發(fā)生下調(diào)，從而導(dǎo)致它在成年小鼠的大多數(shù)器官中缺乏表達(dá)。這就表明CLDN6是一種嚴(yán)格意義上的癌胚細(xì)胞表面抗原，具有適合于CAR-T細(xì)胞靶向的理想表達(dá)譜。相關(guān)研究結(jié)果近期發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“An RNA vaccine drives expansion and efficacy of claudin-CAR-T cells against solid tumors”。

圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.aay5967。 
這些研究人員設(shè)計(jì)出具有4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CLDN6-CAR（即識別并結(jié)合CLDN6的CAR）。針對這種受體結(jié)構(gòu)域，他們設(shè)計(jì)出一種單鏈可變區(qū)片段（scFv），這種scFv在納米摩爾范圍內(nèi)對CLDN6具有高度的特異性和結(jié)合親和力。他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過基因改造后表達(dá)CLDN6-CAR的T細(xì)胞（CLDN6-CAR-T細(xì)胞）可高度靈敏地識別和殺死經(jīng)過CLDN6 RNA轉(zhuǎn)染的CLDN6陰性人肺癌細(xì)胞系COLO699N。此外，CLDN6-CAR-T細(xì)胞僅能殺死經(jīng)過CLDN6 RNA轉(zhuǎn)染的COLO699N細(xì)胞，但不能殺死與CLDN6存在較高氨基酸同源關(guān)系的CLDN3、CLDN4或CLDN9 RNA轉(zhuǎn)染的COLO699N細(xì)胞。

當(dāng)CLDN6-CAR-T細(xì)胞與CLDN6陽性人腫瘤細(xì)胞系共同培養(yǎng)時，他們觀察到干擾素γ（IFNγ）分泌和T細(xì)胞活化標(biāo)志物上調(diào)，但是當(dāng)與CLDN6陰性腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)時，這種情形不會發(fā)生。CLDN6-CAR-T細(xì)胞也能夠高效地清除CLDN6陽性PA-1卵巢癌球狀體。通過CRISPR/Cas9敲除CLDN6可完全廢除CLDN6-CAR-T細(xì)胞對PA-1卵巢癌球狀體的識別，這進(jìn)一步證實(shí)了CLDN6-CAR-T細(xì)胞的高效力和靶標(biāo)特異性。

接下來，這些研究人員研究了CLDN6-CAR-T細(xì)胞在皮下異種移植人腫瘤細(xì)胞系的NSG小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性。這些小鼠接受單劑量人CLDN6-CAR-T細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞移植。相比于疾病快速進(jìn)展的對照組小鼠，所有接受CLDN6-CAR-T細(xì)胞治療的小鼠在2周內(nèi)經(jīng)歷腫瘤完全消退。在注射后25天內(nèi)，循環(huán)CLDN6-CAR-T細(xì)胞仍然能夠在接受治療的小鼠體內(nèi)檢測到。

為了評估這種方法是否具有更廣泛的適用性，這些研究人員選擇了與CLDN6具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系的CLDN18.2。CLDN18.2在多種具有較高醫(yī)療需求的腫瘤（比如胃食管癌和胰腺癌）中表達(dá)。在人類和小鼠中，它在正常組織中的表達(dá)局限于胃粘膜分化細(xì)胞的緊密連接處。他們通過用CLDN18.2特異性的scFv替換CLDN6特異性的scFv，構(gòu)建出CLDN18.2-CAR和表達(dá)CLDN18.2-CAR的CAR-T細(xì)胞（簡稱為CLDN18.2-CAR-T）。CLDN18.2-CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出與CLDN6-CAR-T細(xì)胞相類似的功能特征。

移植的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的定植和持續(xù)存在是它們發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵。然而，就實(shí)體瘤而言，CAR-T細(xì)胞很難接觸到它的腫瘤細(xì)胞，而且在免疫抑制腫瘤微環(huán)境中，CAR-T細(xì)胞接觸靶細(xì)胞時缺乏增殖信號，因此CAR-T細(xì)胞所占的比例下降較快。

近年來，這些研究人員通過靜脈注射攜帶抗原編碼RNA的脂質(zhì)體（liposomal antigen-encoding RNA, RNA-LPX）來刺激癌癥患者的天然細(xì)胞庫中的腫瘤相關(guān)T細(xì)胞。這種納米顆粒疫苗將抗原遞送到脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中的抗原呈遞細(xì)胞（APC），同時啟動依賴于Toll樣受體（TLR）的I型IFN驅(qū)動的免疫激活程序，從而促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的活化和強(qiáng)勁增殖。

為了驗(yàn)證這種方法經(jīng)改進(jìn)后是否可作為CAR-T細(xì)胞增強(qiáng)性RNA疫苗（CAR-T cell Amplifying RNA Vaccine, 簡稱CARVac）發(fā)揮作用，這些研究人員開展了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，他們測試了CLDN6 是否在樹突細(xì)胞表面上展示以便在體外刺激CLDN6-CAR-T細(xì)胞。他們檢測到經(jīng)過不同劑量的編碼CLDN6 的RNA-LPX（簡稱CLDN6-LPX）處理的樹突細(xì)胞表面上CLDN6的劑量依賴性表達(dá)。由此導(dǎo)致的樹突細(xì)胞表面上的CLDN6表達(dá)以一種劑量依賴性的方式誘導(dǎo)了與樹突細(xì)胞共同培養(yǎng)的CLDN6-CAR-T細(xì)胞的激活、細(xì)胞因子分泌和增殖。在給BALB/c小鼠靜脈注射CLDN6-LPX后，CLDN6表達(dá)可在脾臟樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面上檢測到，但在淋巴細(xì)胞表面上并未檢測到，這就證實(shí)CLDN6在體內(nèi)唯一地遞送給抗原呈遞細(xì)胞（比如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）?？乖蔬f細(xì)胞經(jīng)歷成熟，而且在靜脈注射CLDN6-LPX的小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中檢測到自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、B細(xì)胞和T細(xì)胞受到較強(qiáng)的激活。 

接著，C57BL/6小鼠接受經(jīng)過細(xì)胞增殖染料標(biāo)記的CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植，并接種CLDN6-LPX或?qū)φ誖NA-LPX。相比于接種對照RNA-LPX的小鼠，來自接種CLDN6-LPX的小鼠的所有主要身體部位的脾臟和淋巴結(jié)顯示增殖的CLDN6-CAR-T細(xì)胞比例顯著增加，這表明CLDN6抗原在淋巴區(qū)室中發(fā)生廣泛的功能性表達(dá)。

為了評估CARVac策略在體內(nèi)的表現(xiàn)，這些研究人員讓事先接受全身照射的小鼠接受CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植。他們發(fā)現(xiàn)靜脈注射單劑量CLDN6-LPX可導(dǎo)致循環(huán)CLDN6-CAR-T細(xì)胞顯著增殖。這種增殖與CLDN6-LPX劑量水平相關(guān)。CLDN6-CAR-T細(xì)胞比例在接種CLDN6-LPX的3到4天后達(dá)到最高峰，隨后發(fā)生下降。

在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，多組小鼠接受不同劑量水平的CLDN6-CAR-T細(xì)胞注射，開始時低到每只小鼠注射1000個CLDN6-CAR-T細(xì)胞，隨后在CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植后不久接種或者不接種CLDN6-LPX。在不接種CLDN6-LPX的小鼠中，主要的CLDN6-CAR-T細(xì)胞定植與注射的細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)，而且隨著時間的推移保持穩(wěn)定，或者緩慢下降。值得注意的是，在接種CLDN6-LPX的小鼠中，CLDN6-CAR-T細(xì)胞發(fā)生增殖，這種增殖與初始注射的細(xì)胞劑量無關(guān)。CLDN6-LPX介導(dǎo)的1000個CLDN6-CAR-T細(xì)胞的增殖導(dǎo)致外周血中存在可檢測到的CLDN6-CAR-T細(xì)胞水平。幾乎全部移植的CLDN6-CAR-T細(xì)胞群體經(jīng)歷CLDN6-LPX介導(dǎo)的激活和增殖。相比于來自未接種CLDN6-LPX的小鼠的CLDN6-CAR-T細(xì)胞，來自接種CLDN6-LPX的小鼠的CLDN6-CAR-T細(xì)胞一旦與CLDN6陽性的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)時就會產(chǎn)生更高水平的IFNγ和表現(xiàn)出顯著更高的抗原依賴性的溶細(xì)胞活性。此外，接受低劑量CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植的小鼠受益于重復(fù)接種CLDN6-LPX。在接受高劑量CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植的小鼠中，CLDN6-CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖在達(dá)到較高水平后保持穩(wěn)定。

為了評估CLDN6-LPX重復(fù)接種對CLDN6-CAR-T細(xì)胞長期持續(xù)存在的影響，接受CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植的小鼠接種三次周劑量的CLDN6-LPX，隨后再進(jìn)行兩次具有更長無治療間隔（treatment-free interval）---4周和4.5周---的CLDN6-LPX接種。首次CLDN6-LPX接種導(dǎo)致CLDN6-CAR-T細(xì)胞快速增殖超過了兩個數(shù)量級，隨后的每周接種維持較高水平的CLDN6-CAR-T細(xì)胞，從而導(dǎo)致它們在總外周血淋巴細(xì)胞中的比例超過了15%。

鑒于CAR-T細(xì)胞療法的最突出的嚴(yán)重不良事件是細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），這些研究人員探索了CLDN6-CAR-T細(xì)胞與CARVac策略聯(lián)合使用時全身性細(xì)胞因子釋放發(fā)生增加的可能性。他們分析了在接受CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植的小鼠在接種CLDN6-LPX后的血清IFNγ、IL6和NFα水平。除了IFNγ在早期發(fā)生輕度的短暫升高之外，并未觀察到受測的促炎性細(xì)胞因子經(jīng)歷較大的上升。此外，單次接種或重復(fù)接種CLDN6-LPX的小鼠的脾臟在結(jié)構(gòu)上并未顯示出任何明顯的病理變化；在小鼠接受CLDN6-LPX重復(fù)接種后的不同時間點(diǎn)上，它們的脾臟的細(xì)胞組成在CD11c+樹突細(xì)胞和F4/80+巨噬細(xì)胞群體方面發(fā)生輕度的暫時性下降，而在T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞群體方面并未發(fā)生數(shù)量變化。

最后，在荷瘤小鼠中，它們在接受小鼠CLDN6-CAR-T細(xì)胞移植后，接受單次CLDN6-LPX或?qū)φ誖NA-LPX接種。在未接種CLDN6-LPX的情形下，CLDN6-CAR-T細(xì)胞對腫瘤的控制是不完全的，而且腫瘤生長僅是受到延緩。相比之下，在10只接受CLDN6-CAR-T細(xì)胞和CLDN6-LPX聯(lián)合治療的小鼠中，有6只表現(xiàn)出對較大腫瘤的完全排斥，而且具有顯著更高的中位生存期。當(dāng)對荷瘤小鼠進(jìn)行CLDN18.2-CAR-T細(xì)胞和CLDN18.2-LPX聯(lián)合治療時，它們也實(shí)現(xiàn)了類似的治療結(jié)果。

接著，在攜帶CLDN6陽性O(shè)V90異種移植腫瘤的小鼠模型中，他們證實(shí)重復(fù)接種CLDN6-LPX可導(dǎo)致移植到這些小鼠體內(nèi)的人CLDN6-CAR-T細(xì)胞發(fā)生特異性增殖。有效的腫瘤控制與CLDN6-CAR-T細(xì)胞在外周血中的較高比例相關(guān)聯(lián)，從而證實(shí)接種CLDN6-LPX可導(dǎo)致CLDN6-CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生高效增殖和更好地持續(xù)存在。在小鼠的異種移植腫瘤模型中，進(jìn)行CLDN18.2-CAR-T細(xì)胞和CLDN18.2-LPX聯(lián)合治療也可實(shí)現(xiàn)類似的治療結(jié)果。

這些發(fā)現(xiàn)表明CARVac可用于改善CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用。這就為利用CAR-T細(xì)胞治療難以治療的實(shí)體瘤提供了一種新的策略。然而，這些結(jié)果是在臨床前模型中實(shí)現(xiàn)的，它們是否在人體中也是如此，還有待開展進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。（生物谷 世聯(lián)博研Bioexcellence） 

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