CRISPR-Cas9為突破工程化細胞活性掃除障礙

多數(shù)癌癥可被免疫系統(tǒng)識別并攻擊，但是因為腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制和免疫逃逸機制而進展不一。輸注體外工程化T細胞，即T細胞過繼療法(adoptedT cell therapy)，能增加患者的天然抗腫瘤免疫反應(yīng)?；虔煼ㄖ囟ㄏ蛎庖咛禺愋耘c基因編輯相結(jié)合具有改善療效并增加工程化T細胞安全性的潛力。CRISPR與Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶是一項強有力的基因編輯技術(shù)，具有靶向T細胞中多個基因來改善腫瘤免疫療法的能力。

工程化T細胞療法給癌癥治療帶來了革命性的變化，在血液相關(guān)癌癥，如白血病和淋巴瘤的治療過程中獲得了長期持續(xù)的緩解。該療法涉及取出患者T細胞，“重新編輯”使其攻擊癌細胞，然后再將它們轉(zhuǎn)移回患者。使用CRISPR-Cas9的靶基因滅活(敲除)能增強T細胞活性，并且有擴增細胞療法應(yīng)用的潛力。然而直到現(xiàn)在，仍然不知CRISPR-Cas9編輯T細胞在回輸人體后能否耐受并增殖。Stadtmauer等人發(fā)表了I期臨床試驗(NCT03399448)晚期難治性癌癥患者接受CRISPR-Cas9修飾T細胞治療的數(shù)據(jù)，他們將這種細胞稱為CRISPR-Cas9 NYCE T細胞。結(jié)果顯示了基因編輯的治療性應(yīng)用的一項重要進展，并突出了加速開發(fā)細胞療法的潛力。

工程化細胞療法的生產(chǎn)涉及用脫毒病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)分離出的患者T細胞，使其通過表達嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors，CARs)識別呈現(xiàn)在癌細胞表面的抗原，或者通過表達T細胞受體(Tcell receptors， TCRs)識別癌細胞內(nèi)的癌癥相關(guān)多肽抗原。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，工程化T細胞數(shù)量被擴增，然后回輸病人體內(nèi)。雖然對治療一些類型的癌癥高度有效，工程化T細胞活性的特異性和壽命可被改善。例如，T細胞活性通過PD-1(程序性細胞死亡蛋白1)受體被天然下調(diào)。系統(tǒng)性抑制患者的PD-1能增強T細胞活性，但經(jīng)常誘發(fā)不良自體免疫反應(yīng)。此外，內(nèi)源性的TCR表達與工程化T細胞的轉(zhuǎn)基因受體競爭，干擾信號傳遞或細胞轉(zhuǎn)運。敲除TCR基因和編碼PD-1的PDCD1基因在臨床前人腫瘤異種移植小鼠模型中能增強工程化人體T細胞活性。上文提到，Stadtmauer等測試了CRISPR-Cas9敲除這些基因的患者衍生T細胞在回輸人體后是否安全和持久。

一項試驗入組了六名骨髓瘤或肉瘤患者，其中三名滿足T細胞回輸?shù)难芯繕?biāo)準(zhǔn)。通過兩步處理來獲得原生TCR和PDCD1基因敲除，以及在工程化細胞中轉(zhuǎn)基因TCR的表達。在第一步，分離出的患者T細胞用預(yù)成型的Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)電穿孔，并引導(dǎo)RNA靶向內(nèi)源性TCR-TCRα(TRAC)、TCRβ(TRBC)及PDCD1，進行基因中斷。在第二步，細胞用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達轉(zhuǎn)基因TCR，其能識別癌癥-睪丸抗原(NY-ESO-1)，并且在培養(yǎng)基中擴增以產(chǎn)生NY-ESO-1轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR 3X編輯細胞(NYCE)細胞。值得一提的是，NYCE細胞消除了表達NY-ESO-1的細胞，比單獨表達NY-ESO-1 TCR的T細胞更加有效，符合成功敲除內(nèi)源性TCR的預(yù)期結(jié)果。

NYCE細胞成功植入全部患者，并且在回輸9個月之后仍可被檢測到。未經(jīng)CRISPR基因編輯的、表達NY-ESO-1 TCR的T細胞在此前的臨床試驗中輸注后的半衰期約為1周。從一名研究參加者重新分離出的NYCE細胞的基因表達特征與中央記憶細胞一致，標(biāo)志著穩(wěn)定的移植。此結(jié)果與之前的研究形成鮮明對比，表達NY-ESO-1 TCRs的未編輯細胞展示出T細胞耗竭的標(biāo)記物。CRISPR-Cas9對內(nèi)源性TCR和PD-1的中斷改善了工程化T細胞的細胞殺傷能力并且促進了長期的持續(xù)性。

CRISPR-Cas9編輯細胞的人體安全性是必須考慮的重要問題。目前不清楚Cas9編輯的細胞是否將有免疫原性，也不清楚殘留的細菌蛋白Cas9是否將會誘發(fā)免疫反應(yīng)。Stadtmauer等報道在三名患者中未觀察到NYCE細胞的編輯相關(guān)毒性。此外，雖然研究參與者有預(yù)先存在的T細胞和Cas9蛋白的特異性抗體，抗體滴定在整個研究過程中未從基線增加。Cas9免疫反應(yīng)缺失可能歸因于接受NYCE細胞患者的免疫抑制，或者是因為Cas9作為一個非病毒、預(yù)先形成的RNP遞送。與病毒遞送導(dǎo)致被治療細胞持續(xù)表達Cas9相比，RNP在細胞中的半衰期有限。Stadtmauer等也報道了CRISPR-Cas9的最小脫靶編輯，不超過1%的NYCE細胞在回輸后含有染色體易位減少。這些發(fā)現(xiàn)為安全生產(chǎn)和無免疫性給予基因編輯體細胞提供了指南。

現(xiàn)存尚未解答的最大問題是CRISPR編輯的工程化T細胞對于晚期癌癥是否有效。關(guān)于NYCE細胞的I期試驗評估了安全性，但治療患者的療效并未評估。在研究末期，一名參與者因癌癥進展死亡，另外兩名患者接受了其他療法。雖然Cas9工程化細胞的療效因此而模糊，此研究受到2016年出臺的編輯方案限制。此研究的基因中斷效率一般(15到45%)，然而現(xiàn)存的方案使用Cas9RNPs在人T細胞中獲得超過90%的基因中斷。此外，近期工作已證實CAR轉(zhuǎn)基因插入人T細胞TRAC基因，同時導(dǎo)致內(nèi)源性TCR的敲除，同時通過原生啟動子驅(qū)動CAR的表達。在產(chǎn)生精準(zhǔn)基因修飾及其他癌癥相關(guān)靶點選擇方面的進步，可增強工程化T細胞治療其他癌癥的療效，包括實體瘤，大部分對工程化細胞療法的活性具有抗性。

臨床證實的CRISPR基因編輯細胞的長期安全性為下一代基于細胞的療法鋪平了道路。雖然其他類型基因編輯體細胞(如干細胞)的安全性仍然待定，但是振奮人心的消息是首批輸注CRISPR-Cas9修飾細胞的β地中海貧血和鐮狀細胞貧血患者顯示出健康的血液產(chǎn)生。隨著更多的基因標(biāo)記療法被證明安全且有效，臨床轉(zhuǎn)化的障礙將成為細胞制造和給藥。工程化細胞的生產(chǎn)工藝和修飾體內(nèi)靶細胞的CRISPR-Cas9遞送策略亟待重構(gòu)以減少成本，使這些革命性的療法惠及能夠獲益的患者。(生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）

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