規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相關(guān)（CRISPR associated，Cas）蛋白9 （CRISPR/Cas9）技術(shù)是基于細(xì)菌內(nèi)的獲得性免疫機(jī)制改造而成的，其通過(guò)一條單鏈向?qū)NA（single guide RNA，gRNA）來(lái)識(shí)別特定的DNA序列，并引導(dǎo)具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白剪切DNA雙鏈。與鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）等基因編輯技術(shù)相比，改良后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅由gRNA和Cas9蛋白兩部分組成，具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)。

為了明確轉(zhuǎn)染了規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9 （CRISPR/Cas9）表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞所分泌的外泌體中是否存在單鏈向?qū)NA（gRNA）和Cas9蛋白，并探索CRISPR/Cas9系統(tǒng)能否通過(guò)外泌體的細(xì)胞間傳遞，實(shí)現(xiàn)對(duì)周?chē)?xì)胞靶基因的編輯，北京大學(xué)王杰， 陳然， 魯鳳民將CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HuH7細(xì)胞中，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，差速離心法濃縮和純化外泌體，通過(guò)電鏡和馬爾文激光散射粒度測(cè)定儀分別測(cè)定外泌體的形態(tài)和粒徑，并利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)gRNA和Cas9蛋白水平。（2）將分別轉(zhuǎn)染1.2×乙型肝炎病毒（HBV）表達(dá)質(zhì)粒和HBV特異性CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒的HuH7細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。2 d后提取細(xì)胞內(nèi)HBV DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒的HuH7細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體中不僅存在全長(zhǎng)gRNA和Cas9蛋白，并可在細(xì)胞間傳遞其基因編輯功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)周?chē)?xì)胞HBV基因組的破壞。

作為一種潛在的遞送系統(tǒng)，外泌體可通過(guò)攜帶有功能的gRNA和Cas9蛋白在細(xì)胞間傳遞CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能。這一現(xiàn)象也提示我們，在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因治療的過(guò)程中，也需要考慮攜帶有g(shù)RNA和Cas9蛋白的外泌體對(duì)周?chē)斑h(yuǎn)端組織細(xì)胞的潛在影響。(生物谷Bioon.com）

小編推薦會(huì)議  2020（第五屆）外泌體與疾病研討會(huì)

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