肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌類型的85%以上，死亡率高達(dá)80%～90%。由于缺乏有效的早期診斷篩查方法，70%肺癌患者確診時已是晚期，5年生存率僅為16%～18%。因此，尋找新的生物標(biāo)志物和靶向治療的新靶點(diǎn)對肺癌的早期診斷和臨床治療至關(guān)重要。近年來，針對外泌體的研究越來越多，大量研究發(fā)現(xiàn)外泌體通過與腫瘤微環(huán)境相互作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫調(diào)節(jié)、放化療抵抗等多方面影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展。此外，外泌體可為肺癌的早期診斷提供重要信息，具有成為肺癌腫瘤標(biāo)志物的潛力。因此，肺癌外泌體的研究將為肺癌的診斷和治療提供新思路。本文主要從外泌體的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用方面的研究進(jìn)展作一綜述。

外泌體概述

外泌體是由多種活細(xì)胞通過內(nèi)吞-融合-外排等一系列生物學(xué)機(jī)制而形成的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級微小囊泡，其密度為1.13～1.21g/mL，直徑約為30～100nm。外泌體最早是在1983年由Johnstone RM等研究羊成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞過程中囊泡的形成時發(fā)現(xiàn)的。外泌體在電鏡下觀察常呈杯型或雙凹碟型，在人體體液中常呈球型，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、乳汁、腦脊液等多種體液中。通常采用超速離心法、過濾離心法、密度梯度離心法、色譜法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等方法提取得到外泌體。外泌體含有大量生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、病毒和朊病毒等。外泌體中脂質(zhì)成分主要包括膽固醇、鞘磷脂、卵磷脂、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、神經(jīng)節(jié)苷脂、聚甘油磷脂、飽和脂肪酸等，這些脂質(zhì)結(jié)構(gòu)具有提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性的作用。外泌體中含有豐富的蛋白質(zhì)，主要包括膜運(yùn)輸和融合相關(guān)的蛋白質(zhì)如Rab蛋白、GTP酶、膜聯(lián)蛋白等；細(xì)胞骨架成分如肌動蛋白、微管蛋白等；四跨膜蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等；與外泌體形成相關(guān)的蛋白質(zhì)如腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALix）、內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物（ESCRT）等；熱休克蛋白如HSP70、HSP60和HSP90。此外，外泌體還包含與細(xì)胞來源和組織類型相關(guān)的各種特異性蛋白，如主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHCI）、MHCⅡ、細(xì)胞黏附分子等。除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)外，外泌體還包含大量的核酸，如信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（LncRNA）和DNA等。這些成分在腫瘤微環(huán)境內(nèi)相互作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

外泌體在肺癌中的生物學(xué)作用

2.1外泌體在肺癌腫瘤微環(huán)境中的作用

2.1.1外泌體介導(dǎo)腫瘤血管的生成

腫瘤血管是腫瘤細(xì)胞生長和發(fā)展過程中營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源。大量研究表明，肺癌細(xì)胞來源外泌體（LCC-exosome）含有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、miRNA等多種細(xì)胞因子。LCC-exosome將自身所含的細(xì)胞因子釋放到腫瘤微環(huán)境中，通過不同的途徑作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面受體，促進(jìn)肺癌新血管的形成，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、提高肺癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移力。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人類肺癌細(xì)胞A549來源的外泌體分泌的分揀蛋白，與酪氨酸激酶受體B和EGFR形成TES復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞的激活和遷移中起著作用，并在肺癌血管的生成中發(fā)揮作用。Kosaka N等發(fā)現(xiàn)LCC-exosome釋放的miR-210通過分泌中性鞘磷脂酶2（NSMASE2）抑制特異性靶基因，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成。低氧狀態(tài)下誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞向周圍內(nèi)皮細(xì)胞釋放miR-494和外泌體，通過抑制PTEN和Akt/eNOS途徑的激活，促進(jìn)腫瘤血管的生成。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)LCC-exosome分泌的miR-210，通過下內(nèi)皮細(xì)胞中酪氨酸受體激酶A3的水平，促進(jìn)腫瘤血管生成。由此可見，LCC-exosome可以通過多種途徑介導(dǎo)腫瘤血管的形成，進(jìn)而調(diào)控腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。

2.1.2外泌體在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化形成中的作用

上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，主要的特征有細(xì)胞黏附分子表達(dá)的減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細(xì)胞骨架等，EMT是一種能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程。Rahman MA等研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性的肺癌外泌體可誘導(dǎo)正常支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，進(jìn)而通過波形蛋白來驅(qū)動正常支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，使得受體細(xì)胞獲得遷移、侵襲和增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌A549細(xì)胞來源的外泌體釋放的Rab3D蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）能通過不同途徑促進(jìn)EMT，進(jìn)而增強(qiáng)了肺癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。

2.1.3外泌體參與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞形成

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（TAF）由腫瘤基質(zhì)中固有的纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變形成，是腫瘤微環(huán)境的主要基質(zhì)細(xì)胞。研究表明，TAF不僅是腫瘤生長的“土壤”，更能分泌多種細(xì)胞因子，與腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞及其他間質(zhì)細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺癌A549來源的外泌體表面具有的HSP70能夠刺激肺正常間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）產(chǎn)生一種促炎性間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)一步觸發(fā)NF-κB通路快速激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）/Toll樣受體2（TLR2），使IL-6、IL-8、MCP-1分泌增多，促進(jìn)肺癌的生長。研究還發(fā)現(xiàn)人和鼠肺癌模型細(xì)胞來源的外泌體能激活成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)血管生成相關(guān)因子如IL-8、VEGF、LIF、OSM、IL-11和MMP-9，從而促進(jìn)肺癌微環(huán)境血管生成。因此，LCC-exosome參與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移。

2.2外泌體參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)

大量研究表明，外泌體在抑制免疫反應(yīng)或免疫逃逸過程中起到重要的作用。外泌體包含有一些腫瘤特異性抗原，這些特異性抗原通過激活抗原遞呈細(xì)胞（APC）如樹突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞），引起T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Huang SH等研究發(fā)現(xiàn)LCC-exosome攜帶的表皮生長因子受體（EGFR）可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受性樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而生成特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（TREG），TREG具有抑制CD8+T細(xì)胞抗腫瘤功能，從而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。LCC-exosome分泌的miR-21和miR-29A，通過與Toll樣受體（TLR）家族、TLR7和人類TLR8受體結(jié)合，觸發(fā)TLR介導(dǎo)的NF-κB信號通路活化，最終導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。研究證實(shí)，外泌體中的配體如MICA、MICB等通過與NKG2D（MEMBERD）受體結(jié)合，使NKG2D受體表達(dá)下調(diào)，抑制淋巴細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。以上結(jié)果表明，LCC-exosome可介導(dǎo)腫瘤免疫調(diào)節(jié)，參與免疫逃逸，促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展。

2.3外泌體參與腫瘤放化療抵抗

腫瘤化療耐藥和放療耐受及抵抗是導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要原因。研究表明，LCC-exosome在肺癌放化療抵抗過程中發(fā)揮著重要功能。Xiao X等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肺癌A549細(xì)胞暴露于順鉑（DDP）后，外泌體分泌水平升高，A549細(xì)胞釋放的外泌體降低了其他A549細(xì)胞對順鉑的敏感性，同時其他A549細(xì)胞分泌的外泌體增加了A549細(xì)胞對順鉑的抗性。Qin X等研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中提取的外泌體使順鉑對其他癌細(xì)胞具有抗性，A549細(xì)胞外泌體分泌的miR-100-5P的下調(diào)被證實(shí)參與了順鉑的抵抗。研究還發(fā)現(xiàn)使用吉非替尼處理過的PC9人肺癌細(xì)胞系所產(chǎn)生的外泌體降低了順鉑的抗腫瘤作用。此外，Tang Ｙ等研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者接受60Gy放射治療后含miR-208A的外泌體表達(dá)水平升高，進(jìn)一步激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，最終導(dǎo)致肺癌放療抵抗。以上研究表明，外泌體及其分泌的蛋白質(zhì)、miRNA通過不同途徑影響著放化療療效。

外泌體在肺癌診斷中的作用

隨著對肺癌診斷方法研究的深入，目前國內(nèi)外正在廣泛研究血清生物學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合低劑量螺旋CT（LDCT）的肺癌診斷策略，通過血清生物學(xué)標(biāo)志物篩查肺癌是目前研究的熱點(diǎn)和趨勢。研究表明，外泌體分泌的miRNA和蛋白質(zhì)可作為肺癌臨床應(yīng)用中較理想的新的生物學(xué)診斷標(biāo)志物。Giallobardo M等利用定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析NSCLC患者血液中提取的外泌體所分泌的8個miRNA（miR-30B、-30C、103、-122、-195、-203、-221和-222）均與NSCLC相關(guān)；Cazzoli R等采用qPCR研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血液提取的外泌體所攜帶的4種miRNA（hsa-miR-378A、-379、-139-5P和-200B-5P）較健康吸煙者表達(dá)水平高，6種miRNA（hsa-miR-151A-5P、-30A-3P、-200B-5P、-629、-100和-154-3P）在肺腺癌中表達(dá)水平明顯高于肺肉芽腫患者；Rodriguez M等研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液中外泌體含有的miR-122-5P表達(dá)量高于支氣管肺泡灌洗液（BALF）所分離的量。Vanni I等研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液外泌體來源的miR-25和miR-223的表達(dá)水平較正常人升高，而let-7F、miR-20B和miR-30E-3P的表達(dá)水平前者較后者明顯降低，這種差異性表達(dá)為肺癌的診斷帶來潛在應(yīng)用價值。此外，外泌體蛋白質(zhì)也可以作為肺癌標(biāo)志物。Huang SH等研究發(fā)現(xiàn)從NSCLC患者組織提取分離的外泌體蛋白質(zhì)中約80%含有EGFR，在肺部慢性炎癥患者中只有約2%的外泌體蛋白含有EGFR；另一項(xiàng)研究采用EV陣列分析法研究表明外泌體蛋白可作為晚期NSCLC的潛在診斷標(biāo)志物。通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)法研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者尿液來源的外泌體中的人富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是NSCLC非侵入性診斷的候選生物學(xué)標(biāo)志物。Ueda K等通過對1369個外泌體蛋白進(jìn)行質(zhì)譜定量分析，發(fā)現(xiàn)CD91可作為鑒別肺腺癌特異抗原的外泌體，CD91聯(lián)合癌胚抗原（CEA）可作為肺癌診斷標(biāo)志物，兩者聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度均高于單獨(dú)檢測CEA。以上研究表明，外泌體的相關(guān)miRNA和蛋白質(zhì)檢測將為肺癌患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷提供更可靠的依據(jù)。

外泌體在肺癌治療及預(yù)后評估中的作用

大量研究已經(jīng)證明外泌體的相關(guān)研究對肺癌的治療起著重要的作用。目前存在四種潛在的治療策略：①抑制外泌體的產(chǎn)生或分泌，降低外泌體含量。MARLEAｕAM等利用一種AETHLONADPT血漿置換技術(shù)，將含有外泌體的血液過濾，發(fā)現(xiàn)針對性減少外泌體的含量可能成為治療肺癌新技術(shù)；②外泌體可作為抗腫瘤疫苗。研究表明DC細(xì)胞來源的外泌體（DEX）可激活CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤作用。因此，外泌體可作為疫苗用于肺癌的治療新手段。研究發(fā)現(xiàn)在晚期NSCLC患者中，DEX疫苗是可行的，其治療耐受性良好。脂質(zhì)體疫苗BLP-25、TG4010等可能在肺癌免疫治療中起作用，需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。BESSEB等采用DEX疫苗治療NSCLC患者進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)，證實(shí)了在晚期NSCLC患者中，DEX能夠增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK）的抗腫瘤作用；③外泌體可作為藥物傳送載體。外泌體膜與親本細(xì)胞膜的組成相近，可直接與靶細(xì)胞膜融合，同時具有穩(wěn)定性、細(xì)胞靶向性，可作為藥物傳送載體的理想顆粒。Aqil F等將組裝的南蛇藤素-外泌體復(fù)合體（EXO-CEL）在A549和H1299肺癌細(xì)胞系中進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外泌體復(fù)合物抗腫瘤效果較好。通過實(shí)驗(yàn)組裝形成的外泌體-紫衫醇復(fù)合物藥效高于單獨(dú)應(yīng)用paclitaxel；④外泌體可作為肺癌治療新靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)外泌體let-7的表達(dá)水平與肺癌的發(fā)生發(fā)展具有顯著的相關(guān)性，提示外泌體let-7可作為肺癌治療的新靶點(diǎn)。此外，研究表明外泌體在肺癌的治療中具有潛在的預(yù)后評估價值。Munagala R等通過檢測小鼠肺癌模型中腫瘤和血清外泌體的miRNA在原發(fā)和復(fù)發(fā)性肺癌中的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性肺癌中外泌體miR-21和miR-155顯著升高，證明這兩種外泌體miRNA的表達(dá)水平與肺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險具有一定的相關(guān)性。研究還發(fā)現(xiàn)外泌體miR-29A-3P和miR-150-5P的表達(dá)水平具有預(yù)測肺癌放療相關(guān)毒性的價值。

外泌體與循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、血漿游離DNA（cfDNA）同為液體活檢的重要組成，液體活檢將為腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療開辟新紀(jì)元，外泌體的研究也越來越熱門。盡管目前對外泌體在肺癌生物學(xué)作用、診斷、治療、預(yù)后評估中的應(yīng)用價值已有大量的研究和探索，然而外泌體促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究，仍需要對外泌體作為肺癌診斷標(biāo)志物進(jìn)行大樣本的驗(yàn)證和謹(jǐn)慎分析確定。隨著對外泌體生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能的進(jìn)一步研究，以及更深入的理解外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)機(jī)制，相信外泌體在肺癌的診斷和治療上將有廣闊的前景，有望研發(fā)出新的抗腫瘤靶向藥物及臨床腫瘤干預(yù)的一系列措施。(生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）

小編推薦會議  2020（第五屆）外泌體與疾病研討會

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