為了探討人臍帶間充質(zhì)干細胞（HUMSC）外泌體對缺氧條件下人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞的增殖、凋亡及遷移生物學(xué)特性的影響，北京大學(xué)人民醫(yī)院徐寧達， 黃旅珍等人采用組織塊貼壁培養(yǎng)法原代培養(yǎng)HUMSC，擴增傳代至第4代，流式細胞儀鑒定其細胞表面標志物；收集培養(yǎng)第4代HUMSC無血清培養(yǎng)基，分離提取外泌體，在電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)并用免疫印跡法鑒定其CD63、CD9蛋白表達；體外培養(yǎng)RPE細胞用噻唑藍（MTT）法檢測缺氧0、1、2、3、4、5 d的細胞增殖情況；用細胞劃痕實驗檢測缺氧0、24、48、72 h的細胞遷移情況，并結(jié)合細胞凋亡實驗確定缺氧時間。處于生長旺盛期的RPE細胞分為5個組，分別為對照組、缺氧組及不同劑量外泌體預(yù)處理組（100、200、300 μg/ml），培育48 h后采用MTT法觀察各組細胞的增殖能力，Annexin V/碘化丙啶（PI）雙染流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡，細胞劃痕實驗中觀察各組細胞的遷移功能。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流式細胞儀檢測第4代HUMSC的表面標志CD105、CD73、CD90呈強陽性表達，體外誘導(dǎo)成脂和成骨細胞，提示分離培養(yǎng)的HUMSC具有MSC特異性表型。分離的外泌體經(jīng)掃描電鏡觀察可見大小不一的球狀膜性結(jié)構(gòu)，且免疫印跡法結(jié)果提示CD63、CD9呈陽性表達。體外培養(yǎng)RPE在缺氧0、1、2、3、4、5 d用MTT法檢測細胞增殖結(jié)果：與對照組比較，吸光度（A）值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，前2 d隨缺氧時間延長，RPE細胞的增殖能力逐漸增強（A值為1.862±0.135和2.278±0.244）；3 d后RPE細胞的增殖能力逐漸減弱（A值為1.419±0.124和1.599±0.156）。細胞劃痕實驗結(jié)果：隨著缺氧時間的延長，RPE細胞遷移距離逐漸增加，至72 h全部長滿且無縫隙。RPE細胞凋亡實驗檢測結(jié)果：缺氧前2 d，隨缺氧時間延長細胞凋亡數(shù)量有差別[3.628%±1.348%、20.123%±1.183%]，3 d時細胞凋亡數(shù)量較多（42.290%±3.217%），與2 d比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。缺氧48 h后MTT法檢測細胞增殖結(jié)果：與對照組（1.870±0.499）比較，缺氧組（2.616±0.307）細胞增殖數(shù)顯著增加（t=-3.116，P<0.05）；與缺氧組比較，外泌體預(yù)處理組細胞增殖數(shù)減少（2.041±0.115、1.931±0.205、1.929±0.025）（t=-4.290，-4.547，-5.286；P<0.01），外泌體各劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.181，P>0.05）。采用Annexin V/PI雙染流式細胞儀觀察細胞凋亡結(jié)果：與對照組（1.180%±0.689%）比較，缺氧組細胞凋亡數(shù)（19.273%±1.194%）顯著增加（t=-32.141，P<0.01）；與缺氧組比較，外泌體預(yù)處理組的細胞凋亡數(shù)顯著減少（12.318%±1.087%、11.878%±1.348%、11.090%±1.716%；t=-10.547，-10.057，-9.589；P<0.01），外泌體各劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.173，P>0.05）。細胞劃痕實驗結(jié)果：與對照組比較，缺氧組細胞遷移距離顯著增加；與缺氧組比較，外泌體預(yù)處理組細胞遷移距離減?。╰=11.766，10.770，11.311；P<0.01]，外泌體各劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.179，P>0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)HUMSC外泌體可有效抑制缺氧狀態(tài)下人RPE細胞增殖、凋亡及遷移，為尋找缺氧導(dǎo)致RPE相關(guān)疾病的研究和治療提供理論依據(jù)。(生物谷Bioon.com）

小編推薦會議  2020（第五屆）外泌體與疾病研討會

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