結(jié)腸直腸癌（CRC）是全球診斷率排名第三的消化道惡性腫瘤。2018年，約有881，000人死于CRC。據(jù)統(tǒng)計，超過70％的CRC位于結(jié)腸，也就是結(jié)腸癌（CC）。CC在北美、歐洲和澳大利亞等地區(qū)的發(fā)病率和死亡率非常高。近年來，亞洲國家CC的發(fā)病率也逐年遞增，CC的診斷和治療已成為全球關(guān)注的熱點問題。

早期CC患者可以通過手術(shù)等手段得到治療，5年生存率已超過90%，但晚期CC患者的中位生存期不到2年。顯然，CC的早期診斷有利于提高患者的生存率，改善臨床治療結(jié)果。但到目前為止，除了內(nèi)窺鏡檢查，幾乎沒有其他任何方法可用于CC的早期診斷。大多數(shù)CC篩查僅根據(jù)參與者的年齡、性別以及其他流行病學(xué)因素進(jìn)行初步診斷，導(dǎo)致篩查的依從性低和醫(yī)療資源大量浪費(fèi)。因此，臨床迫切需要一種侵入性小且易操作的CC早期診斷替代方法。

目前，液體活檢已經(jīng)成為癌癥早期診斷的重要研究方向。miRNAs能夠通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)來控制基因表達(dá)，在胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)和其他生物過程中起著至關(guān)重要的作用。已有研究表明，血漿、血清和尿液中的循環(huán)miRNA有作為癌癥和其他疾病的無創(chuàng)生物標(biāo)志物的潛力。

循環(huán)miRNA來源于癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、凋亡細(xì)胞甚至壞死細(xì)胞，且具有高度異質(zhì)性。但目前對循環(huán)miRNA的生物學(xué)功能仍知之甚少，這在很大程度上限制了其作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用潛力。miRNA的另一個重要來源是外泌體——小細(xì)胞外囊泡（sEV）。sEV的膜可以有效地保護(hù)內(nèi)部miRNA免受RNase的影響，從而使得sEVs衍生的miRNA比血液等體液中的循環(huán)miRNA更可靠。多項研究顯示，小細(xì)胞外囊泡（sEV）在多種疾病的早期檢測中有著重要作用，但對于sEV衍生miRNA作為早期CC特異生物標(biāo)志物的系統(tǒng)篩選尚未有報道。

近日，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化分中心團(tuán)隊與北京恩澤康泰團(tuán)隊合作的研究成果發(fā)表在國際外泌體頂級期刊Journal of Extracellular Vesicles（IF=11）。該研究首次報道了早期結(jié)腸癌患者血漿外泌體的miRNA圖譜，開發(fā)了可高效識別早期結(jié)腸癌的外泌體液體活檢方案，并發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA比血漿游離miRNA更適合消化道早期癌癥診斷，可以作為CC早期診斷的一種潛在生物標(biāo)志物。

為對早期結(jié)腸癌的特異性血漿sEVs標(biāo)志物進(jìn)行系統(tǒng)性的篩選和驗證，該研究團(tuán)隊以血漿sEVs-miRNAs作為早期結(jié)腸癌標(biāo)志物，從miRNA特征鑒定、差異miRNAs篩選、標(biāo)志物篩選及驗證、標(biāo)志物在早期結(jié)腸癌中的驗證、診斷性能比較等方面，系統(tǒng)對比分析了CC患者和正常對照（NC）血漿總miRNAs。

1. sEVs的特征鑒定

利用透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒追蹤分析技術(shù)（NTA）和蛋白質(zhì)印跡法（WB），研究人員對來自15名CC患者和10名正常對照的sEVs進(jìn)行了表征分析。初步研究結(jié)果顯示，經(jīng)血漿總RNA歸一后，CC患者和NC的sEVs RNA濃度、血漿總RNA濃度以及sEVs RNA在百分比方面均無顯著差異（圖1）。

2. CC患者和NC血漿中sEVs差異miRNAs的篩選

同時，研究人員還對血漿sEVs進(jìn)行了miRNA測序及差異miRNA分析（圖2）。結(jié)果顯示，有60個差異表達(dá)miRNA（DEMs）與TCGA數(shù)據(jù)庫有重疊，且每個DEM在sEVs和TCGA中有著相似的靈敏度和特異性。這60個DEMs對應(yīng)的靶基因涉及細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移、ATP結(jié)合、生物合成等功能以及癌癥相關(guān)通路。

3. 結(jié)腸癌相關(guān)sEVs miRNAs標(biāo)志物篩選及驗證

基于上述60個DEMs，研究人員從已報道的結(jié)直腸癌標(biāo)志物中篩選出4個候選miRNA標(biāo)志物：let-7b-3p、miR-150-3p、miR-145-3p和miR-139-3p。此外，研究人員在RNA提取前進(jìn)行了蛋白酶K和RNase的消化驗證（圖3）。研究結(jié)果顯示，4種標(biāo)志物在sEVs中未降解，而在血漿中經(jīng)酶消化后部分降解；陽性對照miR-21-5p和miR-30a-5p（已知的RNP相關(guān)miRNA）在相同處理下幾乎完全降解，表明候選miRNAs在sEVs中受到sEVs膜的保護(hù)。

在結(jié)腸癌早期診斷的驗證試驗中，研究人員利用RT-qPCR方法在134例樣本（58例CC，76例NC）中驗證了sEVs來源的let-7b-3p、miR-150-3p、miR-145-3p和miR-139-3p的診斷性能（圖4）。研究數(shù)據(jù)顯示，四個miRNA的曲線下面積（the area under the ROC curve，AUC）分別為0.792、0.686、0.692和0.679。經(jīng)過進(jìn)一步邏輯回歸模型分析，let-7b-3p、miR-145-3p和miR-139-3p的組合AUC可高達(dá)0.927。

4. miRNA診斷性能比較

sEVs中的miRNA是血漿總miRNA的一部分，為研究sEVs來源miRNA作為生物標(biāo)志物的必要性，該研究對比分析了sEVs來源miRNA和血漿總miRNA中候選標(biāo)志物的診斷性能（圖5）。結(jié)果顯示，與血漿總miRNA相比，sEVs來源miRNA有著更高的AUC和診斷潛能。對比多個miRNA panels，分離后的sEVs miRNA在早期CC患者的識別、診斷中有著非常明顯的優(yōu)勢。 (生物谷Bioon.com）

小編推薦會議  2020（第五屆）外泌體與疾病研討會

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