急性髓細(xì)胞性白血?。ˋML）是一類起源于白血病干細(xì)胞(LSC)的惡性克隆性疾病，但由于癌癥干細(xì)胞的豐度低且與健康的造血干細(xì)胞（HSC）具有高度相似性而難以分離，因此阻礙了國(guó)際上針對(duì)靶向人體惡性細(xì)胞同時(shí)保留正常細(xì)胞的精密治療方法的研究。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組克隆追蹤鑒定白血病及白血病前期干細(xì)胞

具有高細(xì)胞更新率的組織（例如造血系統(tǒng)或腸道）依賴于“專業(yè)”成年干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行持續(xù)再生。這些細(xì)胞中的致癌突變可導(dǎo)致癌癥，使癌癥保持原始組織的層次結(jié)構(gòu)。只有位于頂層的癌癥干細(xì)胞（CSC）才能促進(jìn)長(zhǎng)期的癌癥生長(zhǎng)并推動(dòng)復(fù)發(fā)，而大部分癌癥由迅速分裂的細(xì)胞組成，這些細(xì)胞具有自我更新的能力，即在有限的2至4次分裂后耗盡其復(fù)制潛能的細(xì)胞。由于具有干細(xì)胞樣特性，CSC構(gòu)成了復(fù)發(fā)的重要驅(qū)動(dòng)力，但其低分裂率使它們難以靶向治療。因此，迫切需要能夠可靠地識(shí)別和表征CSC的工具。

基于此，來(lái)自美國(guó)加利福尼亞州帕洛阿爾托市斯坦福基因組技術(shù)中心Lars M Steinmetz教授，帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)證明了通過(guò)結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和沿襲追蹤使用核和線粒體體細(xì)胞變異體，可以鑒定出LSCs，HSCs和白血病前干細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行分子譜分析。雖然突變狀態(tài)可以區(qū)分健康細(xì)胞和癌細(xì)胞，但基因表達(dá)可以區(qū)分干細(xì)胞和祖細(xì)胞群。相關(guān)研究成果以“Identification of leukemic and pre-leukemic stem cells by clonal tracking from single-cell transcriptomics”為題，在線發(fā)表在《Nature Communication》雜志上。

為了建立用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中人類細(xì)胞的克隆追蹤的魯棒實(shí)驗(yàn)裝置，研究人員評(píng)估了Smart-seq2協(xié)議的各種修改，旨在增加目標(biāo)多態(tài)性基因組位點(diǎn)的覆蓋率。其中發(fā)現(xiàn)在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中包含靶向引物經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致形成不希望的副產(chǎn)物，特別是在靶向更多位點(diǎn)時(shí)。相比之下，當(dāng)在cDNA擴(kuò)增過(guò)程中將目標(biāo)位點(diǎn)作為目標(biāo)時(shí)，該研究團(tuán)隊(duì)獲得了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)與非目標(biāo)方法相比，每個(gè)細(xì)胞捕獲的目標(biāo)位點(diǎn)的平均數(shù)目增加了2-4倍。MutaSeq可以穩(wěn)定地與多達(dá)30–40個(gè)引物對(duì)（靶標(biāo)）結(jié)合使用，當(dāng)包含更多引物時(shí)，文庫(kù)質(zhì)量逐漸降低。在僅使用高度表達(dá)的靶基因的測(cè)試中，實(shí)際上是在所有單個(gè)細(xì)胞中從所有引物對(duì)創(chuàng)建了靶擴(kuò)增子。

然后，研究人員將單細(xì)胞水平的核基因組突變以及線粒體突變稱為單細(xì)胞水平，以將細(xì)胞聚類為克隆層次?；颊叩拇罅客怙@子組測(cè)序已鑒定出以高等位基因頻率出現(xiàn)的已知白血病前突變和以稍低等位基因頻率出現(xiàn)的已知白血病突變（患者1：突變SRSF2，TET2 / CEBPA和SRSF2，TET2 / KLF7 ; 患者2：DNMT3A / NPM1中的突變；患者3：SRSF2 / IDH2突變；患者4：白血病三體性8和BRAF突變）。盡管可以僅根據(jù)這些核體細(xì)胞突變的調(diào)用來(lái)得出關(guān)于克隆層次的某些陳述，但是這些位點(diǎn)的相對(duì)較高的缺失 阻礙了細(xì)胞對(duì)克隆的穩(wěn)健分配。此外，結(jié)果受到感興趣的突變基因的表達(dá)水平的影響：在低表達(dá)的細(xì)胞中，失靶率更高，導(dǎo)致假陰性檢出率更高，即以突變細(xì)胞的錯(cuò)誤分類作為參考。

為了進(jìn)一步證明該研究團(tuán)隊(duì)鑒定從頭克隆的能力，研究人員著重介紹了P2中非白血病細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。這個(gè)克隆將已經(jīng)通過(guò)的辦法單獨(dú)依靠基因突變錯(cuò)過(guò)了。有趣的是，這些細(xì)胞與白血病前的DNMT3A突變無(wú)關(guān)。通過(guò)再次使用β-二項(xiàng)式模型查詢來(lái)自COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)的位點(diǎn)，確定了它們?cè)赗PL3基因中具有獨(dú)特的突變。這些結(jié)果表明，該克隆擴(kuò)增事件與白血病無(wú)關(guān)，并且與無(wú)關(guān)核突變的獲得有關(guān)。研究人員還注意到一個(gè)單個(gè)線粒體變體（5492T> C）標(biāo)記的P1中假定的非白血病克隆。除了一個(gè)例外，所有攜帶這種變異的細(xì)胞都對(duì)T細(xì)胞標(biāo)記CD3呈陽(yáng)性反應(yīng)。因此，盡管不能正式排除它對(duì)應(yīng)于T細(xì)胞特異性RNA編輯事件，但該變異可能是在T細(xì)胞前體或T細(xì)胞克隆中獲得的。

綜上所述，該研究描述了一種聯(lián)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和克隆跟蹤方法（MutaSeq和mitoClone），用于表征LSC，繪制其分化能力并繪制致癌突變的分子結(jié)果。雖然單細(xì)胞基因表達(dá)譜分析可以鑒定具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞，但是使用基因組和線粒體突變進(jìn)行克隆追蹤可以在健康克隆和癌性克隆之間進(jìn)行清晰的分離。因此，本研究區(qū)分了LSC、HSC、LSC前、健康祖細(xì)胞和胚細(xì)胞，且已經(jīng)在急性髓細(xì)胞性白血病的背景下證明了這種方法，進(jìn)一步表明類似的方法可以應(yīng)用于其他類型的癌癥。

小編推薦會(huì)議 2021 （第四屆）單細(xì)胞多組學(xué)研究與臨床應(yīng)用峰會(huì)

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