小細(xì)胞肺癌（SCLC）是肺癌中惡性程度最高的類型，占所有肺癌病例的15%，其增殖速度快并且預(yù)后極差，早期患者的五年生存率為15%-30%，而晚期患者則不到1%[1]。

對(duì)于延長(zhǎng)患者的生存期，在一線化療中加入免疫治療帶來的效果很有限[2]。究其原因，還是科學(xué)家們對(duì)SCLC異質(zhì)性特征及其背后涉及的分子通路了解的不多。

想要知道的更多？那自然是像我們看圖片一樣——需要更高分辨率的數(shù)據(jù)。

近日，由紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的Dana Pe’er和Charles M. Rudin領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)在Cancer Cell期刊發(fā)表重要研究成果[3]。

他們對(duì)來自49個(gè)肺癌相關(guān)的組織樣本的155098個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序（其中包括54523個(gè)SCLC細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)了一個(gè)出現(xiàn)在多個(gè)亞型中的以PLCG2高表達(dá)為特征的SCLC細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞有著干細(xì)胞樣和高轉(zhuǎn)移潛力的特征，并且與更差的預(yù)后有關(guān)，對(duì)于臨床治療具有重大意義。

肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（包括肺腺癌、肺鱗癌、肺腺鱗癌等），盡管在形態(tài)學(xué)上SCLC在患者間看起來并無二致，但大量的研究數(shù)據(jù)顯示，SCLC可根據(jù)ASCL1、NEUROD1、POU2F3（SCLC-A、-N和-P型）以及YAP1這四個(gè)基因的差異表達(dá)分為不同的亞型[4]。

然而這樣的分類帶來了新的問題，這些亞型與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移潛力和免疫微環(huán)境的關(guān)系仍然未知。

為了深入探究這些問題，Pe’er和Rudin團(tuán)隊(duì)對(duì)來自49個(gè)樣本（21個(gè)SCLC、24個(gè)LUAD以及4個(gè)癌旁組織）的155098個(gè)細(xì)胞（54523個(gè)SCLC細(xì)胞）進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。SCLC和LUAD隊(duì)列都包括接受過治療和無治療史患者，同時(shí)所取的樣本也包括轉(zhuǎn)移和原位組織。

與LUAD相比，SCLC的拷貝數(shù)變異數(shù)量更多，并且SCLC在患者間的異質(zhì)性也更大，甚至在沒有接受過治療的患者中也是這樣。

接著，研究人員利用鄰接圖的方法對(duì)54523個(gè)SCLC細(xì)胞重新進(jìn)行了亞型無監(jiān)督聚類?；谥皥?bào)道的四個(gè)基因ASCL1、NEUROD1、POU2F3和YAP1，可以分成三類，分別是SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P。但事實(shí)上還有一類研究人員認(rèn)為屬于TP53型。

由于YAP1表達(dá)量較低，所以沒有發(fā)現(xiàn)SCLC-Y，這個(gè)分析結(jié)果得到了各類間標(biāo)志基因表達(dá)量差異驗(yàn)證。

在重現(xiàn)了已有結(jié)論后，Dana Pe’er和Charles M. Rudin團(tuán)隊(duì)開始探究SCLC各種亞型與腫瘤發(fā)展的關(guān)系。由于他們的數(shù)據(jù)里只有一個(gè)樣本屬于SCLC-P型，因此接下來的分析便集中于SCLC-A和-N型。

與已有研究一致的是，他們發(fā)現(xiàn)SCLC-A大多是原位腫瘤，而SCLC-N則大部分是轉(zhuǎn)移瘤，并且SCLC-N的患者間異質(zhì)性要比SCLC-A大得多。這些證據(jù)支持了臨床前模型中SCLC-N可以由SCLC-A進(jìn)化而來的現(xiàn)象[5]。

在差異表達(dá)和通路分析中，他們發(fā)現(xiàn)SCLC-A中上調(diào)的是調(diào)控細(xì)胞周期發(fā)展的基因，而SCLC-N則呈現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)模式，這表明SCLC-N與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

由此可見SCLC的各亞型的轉(zhuǎn)錄組之間存在很大的差異，這與SCLC患者大都有著較差的預(yù)后形成反差。研究人員猜測(cè)在大部分患者的腫瘤中應(yīng)該存在一種與不良預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞亞群，才能解釋這樣的反差。

他們利用SCLC細(xì)胞的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析，共得到25個(gè)不同的細(xì)胞亞群，大部分亞群都只存在于單一的腫瘤樣本中，但是22號(hào)亞群卻在許多腫瘤樣本中都存在，并且有著最高的亞型不確定性，表明22號(hào)亞群細(xì)胞有干細(xì)胞特征。

果然，基因富集分析發(fā)現(xiàn)22號(hào)亞群中的細(xì)胞中上調(diào)了與腫瘤轉(zhuǎn)移和神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的基因。這些上調(diào)的基因中，差異最大的基因是PLCG2，研究人員認(rèn)為它可能是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)基因。

與設(shè)想一致的是，和肺部的原位瘤相比，轉(zhuǎn)移瘤中的PLCG2表達(dá)量更高，并且在肝轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)量最高，這是SCLC最常見的轉(zhuǎn)移部位。

為了得到更有力的證據(jù)，研究人員接著做了體外培養(yǎng)和小鼠實(shí)驗(yàn)。在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，他們分別在PLCG2低表達(dá)的細(xì)胞系（SHP-77）中過表達(dá)PLCG2，以及在PLCG2高表達(dá)的細(xì)胞系（H526）中敲除PLCG2，之后又將這兩種處理過的細(xì)胞系移植到小鼠體內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外PLCG2的表達(dá)賦予了細(xì)胞更強(qiáng)的遷移能力和侵襲性；而在小鼠體內(nèi)，PLCG2的表達(dá)同樣使得腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛力。

這些結(jié)果表明PLCG2很有可能是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)基因。回到最開始的問題，在大多數(shù)患者中存在的PLCG2高表達(dá)22號(hào)細(xì)胞亞群是否與更差的預(yù)后有關(guān)呢？

研究人員在一個(gè)獨(dú)立的SCLC隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)：患者腫瘤組織中表達(dá)PLCG2的細(xì)胞比例與總生存期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.34，p=0.04）。這個(gè)隊(duì)列的生存分析也發(fā)現(xiàn)：表達(dá)PLCG2的細(xì)胞比例較高的患者總生存期更短。

但是PLCG2高表達(dá)畢竟只是22號(hào)亞群細(xì)胞的一個(gè)特征，更進(jìn)一步的分析表明：患者腫瘤組織中22號(hào)亞群細(xì)胞的比例與總生存期呈更強(qiáng)的負(fù)相關(guān)（r=-0.65，p=0.009），生存分析的結(jié)果也是一致的。研究人員據(jù)此認(rèn)為有干細(xì)胞樣、強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力并且高表達(dá)PLCG2的22號(hào)亞群細(xì)胞，對(duì)SCLC患者的預(yù)后有較大的影響。

Dana Pe’er和Charles M. Rudin團(tuán)隊(duì)接著研究了SCLC其他的一些特征。

一直以來，SCLC被認(rèn)為是一種免疫“冷”腫瘤（缺乏免疫細(xì)胞），因此免疫治療的效果很有限。但最近的研究認(rèn)為SCLC的免疫微環(huán)境存在亞型之間的異質(zhì)性。

研究人員利用流式細(xì)胞術(shù)在他們的樣本以及一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)：不論是SCLC-N還是SCLC-A中的免疫細(xì)胞（CD45+）數(shù)量都比LUAD少，并且SCLC-N的更少。

然后他們利用MIBI（多路離子束成像）技術(shù)得到了每個(gè)腫瘤樣本中的免疫細(xì)胞在空間中的分布，并且根據(jù)在800800范圍內(nèi)免疫細(xì)胞的數(shù)量將腫瘤分成了“冷”、“熱”（免疫細(xì)胞數(shù)量>250）腫瘤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分的SCLC樣本都屬于“冷”腫瘤，并且SCLC-N型更為明顯。

SCLC各亞型間免疫微環(huán)境總體的差異分析完，研究人員接著探究了T細(xì)胞在亞型間的差異。他們利用非負(fù)矩陣分解方法將他們SCLC樣本中的免疫細(xì)胞分成30類，其中7類對(duì)應(yīng)的是不同類型的T細(xì)胞。經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SCLC-N有更多的Treg和耗竭CD8+ T細(xì)胞，SCLC-A則有更多的效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞和Tgd。

并且SCLC-N中效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞與Treg數(shù)量的比值更低，后續(xù)的成像技術(shù)分析得到了一致的結(jié)果，有研究證明這個(gè)比值更低在多種癌癥中意味著更差的預(yù)后[6]。

最后，研究人員分析了SCLC樣本中髓樣細(xì)胞的特征。他們對(duì)SCLC樣本中的髓樣細(xì)胞根據(jù)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了重聚類，產(chǎn)生了7種單核/巨噬細(xì)胞（Mono/M）、4種中性粒細(xì)胞、2種樹突狀細(xì)胞。

隨后，由于功能的相似性，他們將7種Mono/M細(xì)胞亞群與特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者的髓樣細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Mono/M1與IPF相關(guān)的髓樣細(xì)胞基因表達(dá)特征最相似。

在結(jié)合了LAUD和肺部正常組織中的髓樣細(xì)胞后，研究人員對(duì)三種樣本中的髓樣細(xì)胞再次進(jìn)行了聚類，他們發(fā)現(xiàn)與IPF類似的Mono/M細(xì)胞在SCLC中的比例更高，甚至在未經(jīng)治療的樣本中也是一樣。

于是，研究人員猜測(cè)這類纖維化的Mono/M細(xì)胞可能通過與特定的SCLC細(xì)胞亞群互作來促進(jìn)腫瘤發(fā)展。他們發(fā)現(xiàn)SCLC-A與Mono/M2和12顯著相關(guān)，而SCLC-N則與Mono/M1和9相關(guān)，并且之前討論過的22號(hào)細(xì)胞亞群與Mono/M1和7顯著相關(guān)。

這就再次回到了22號(hào)細(xì)胞亞群，研究人員又分析了它與非髓樣免疫細(xì)胞亞群的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它與耗竭CD8+T細(xì)胞有顯著關(guān)聯(lián)。后續(xù)的成像分析證明了這些結(jié)論。

最終，Dana Pe’er和Charles M. Rudin團(tuán)隊(duì)認(rèn)為：22號(hào)細(xì)胞亞群可能存在于以耗竭CD8+T細(xì)胞，以及纖維化的Mono/M細(xì)胞為特征的免疫微環(huán)境中。(世聯(lián)博研(Bioexcellence)世聯(lián)博研Bioexcellence）

小編推薦會(huì)議 2021 （第四屆）單細(xì)胞多組學(xué)研究與臨床應(yīng)用峰會(huì)

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