環(huán)狀RNA（circRNA）是一種新興的內源性非編碼RNA（ncRNA），它們參與細胞增殖、粘附、凋亡和存活等多個生物學過程[1]。

近年來，circRNAs在腫瘤領域也獲得了越來越多的關注。有研究表明許多circRNA能促進細胞周期發(fā)展，抑制或誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制血管生成等等[2]，各種不同的circRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著不同甚至相反的作用。

雖然越來越多的研究報道了乳腺癌、肺癌和結直腸癌中異常的circRNAs[3]，但circRNAs在腫瘤細胞中的生物學功能、分子機制和環(huán)狀模式尚不清楚。此外，還有研究提出circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體分泌到循環(huán)中[4]，且比線性RNAs更容易被分選進入外泌體。然而，circRNAs的外泌體特異性分選機制也仍然完全未知。

近日，來自浙江大學張紅河和中國藥科大學來茂德領銜的研究團隊，闡明了circRHOBTB3在結直腸癌（CRC）進展中的生物學作用、環(huán)化過程和分泌途徑，這一結果發(fā)表在Molecular Cancer期刊上。

他們發(fā)現(xiàn)，抑瘤circRHOBTB3通過外泌體被癌細胞排出，以維持結直腸癌細胞的活性。此外，他們還設計了靶向circRHOBTB3的環(huán)狀化和分泌元件的反義寡核苷酸（ASOs），用于CRC的治療。

論文首頁截圖

circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3轉錄后剪接和環(huán)狀化而產生的一種circRNA。RHOBTB3作為Rho GTPase家族ATP酶，參與膜轉運[5、6]和蛋白酶體降解[7]。

先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝細胞癌（HCC）中作為腫瘤抑制circRNA。然而，它的循環(huán)模式和外泌體分泌途徑并未被闡釋。

首先，研究人員分析了來自GEO數據庫的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌（PAAD）患者和14例健康供體的血清外泌體的總RNA-seq數據。

結果顯示，許多circRNAs在腫瘤患者血清外泌體中的表達程度不同（圖1A），但在所有三種癌癥來源的外泌體中，只有hsa_circ_0007444（circRHOBTB3）均表達上調（圖1B），且其宿主基因RHOBTB3在三種腫瘤組織中的表達與正常組織相比均無顯著性的增強（圖1C）。

圖1 不同類型癌癥中ircRHOBTB3在患者血清外泌體中的表達情況

然而，對來自浙江大學醫(yī)學院邵逸夫醫(yī)院體檢的18例CRC患者和16例健康供者的血清樣本數據分析發(fā)現(xiàn)，與健康供者相比，circRHOBTB3在CRC組織中顯著下調，而宿主基因RHOBTB3顯著上調（圖2左二）。而且，在69個CRC組織樣本中檢測到的circRHOBTB3的表達結果顯示，circRHOBTB3水平較高患者的總生存期更好（圖2右一）。

圖2  ircRHOBTB3在CRC組織中患者血清外泌體中的表達情況

于是，研究者不禁假設，circRHOBTB3是否具有抑癌作用？

為了驗證這一點，他們先確定了CRC患者血清外泌體中的circRHOBTB3確實來源于腫瘤細胞而非基質細胞（圖3A），且circRHOBTB3水平在來自NCM460細胞（正常的腸上皮細胞系）的外泌體中最低（圖3B）。進一步在RKO、HCT116細胞（CRC細胞系）中過表達或敲低circRHOBTB3，結果表明circRHOBTB3可以抑制細胞遷移和侵襲能力（圖3C）。

圖3  circRHOBTB3來源與功能的體外驗證實驗

并且，他們通過對circRHOBTB3敲除/重新表達細胞系RNA-Seq數據的分析，以及RT-qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，在circRHOBTB3敲除的細胞系中代謝、增殖和上皮間充質轉化（EMT）通路相關基因顯著上調，而circRHOBTB3的重新表達降低了這些基因的表達。此外，circRHOBTB3敲除的細胞系中ROS水平也顯著升高。

他們還發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3的結合蛋白是ENO1和ENO2。也就是說，circRHOBTB3可能通過與ENO1和ENO2等代謝酶相互作用，調節(jié)細胞內ROS水平，抑制腫瘤細胞增殖和EMT。

為了驗證circRHOBTB3在體內的功能，研究人員將過表達circRHOBTB3的HCT116細胞（CRC細胞系）皮下注射到裸鼠體內，構建了異種移植瘤模型。研究發(fā)現(xiàn)，與不表達circRHOBTB3的對照（EV）組相比，circRHOBTB3過表達（circRHOBTB3-OE）組的腫瘤體積和重量都顯著更小，且細胞增殖能力也更弱（圖4A、B、C）。

而當他們在裸鼠脾臟接種實驗中觀察肝轉移表型時發(fā)現(xiàn)，circRHOBTB3-OE組肝轉移灶少于EV組（圖4D、E）。更為有趣的是，circRHOBTB3可以在異種移植瘤小鼠模型的血漿和尿液中檢測到，而在野生型小鼠的血漿和尿液中則沒有。此外，circRHOBTB3-OE組的血漿中circRHOBTB3的水平高于EV組（圖4F、G）。

圖4  circRHOBTB3功能的體內驗證實驗

根據這些數據，研究者們推測CRC細胞必須通過外泌體分泌抑制腫瘤的circRHOBTB3來維持腫瘤侵襲和轉移的特征，換言之，CRC細胞有特殊的“排毒”機制。

在隨后的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了circRHOBTB3的環(huán)化機制，還發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3本身的順式元件（141–240nt，141-165nt，216-240nt）可以調節(jié)circRHOBTB3通過外泌體的分泌過程（圖5）。

圖5  轉染了截斷的circRHOBTB3載體的細胞中circRHOBTB3外泌體分泌豐度

之前已經有研究發(fā)現(xiàn)，ESCRT-II亞復合物作為一種RNA結合復合物，可以將RNA分選至外泌體[8]中。在該文研究中，他們發(fā)現(xiàn)SNF8可以結合到circRHOBTB3的141-240nt區(qū)域，促進circRHOBTB3被分選至外泌體并分泌到胞外。他們將這個過程被定義為“腫瘤外泌體逃逸機制”（圖6）。

圖6  SNF8敲低實驗以及外源的RIP實驗

受上述研究結果啟發(fā)，研究人員設計了二代ASOs，以增加circRHOBTB3的環(huán)化并減少分泌，這有望成為一種新的癌癥治療策略。

研究人員設計了三種二代ASOs：一個靶向負環(huán)化的元件（ASO-cir：266-290nt）和兩個外泌體分泌的元件（ASO-exo1：141-165nt，ASO-exo2：216-240nt）（圖7）。

通過實驗他們發(fā)現(xiàn)，ASO-cir確實能增加circRHOBTB3的環(huán)化，但circRHOBTB3的分泌卻會同時增加；而ASO-exo1和ASO-exo2中，僅ASO-exo2（以下簡稱ASO-exo）既增加circRHOBTB3的胞內水平，又阻斷circRHOBTB3外泌體的分泌。因此，研究者們考慮進一步使用ASO-cir和ASO-exo，研究二者聯(lián)合治療對結直腸癌的特異性和抗腫瘤效果。

圖7 二代ASOs及其作用機制

研究人員驗證了ASOs的聯(lián)合用藥的確比ASO-cir和ASO-exo的單獨用藥能產生更多的胞內circRHOBTB3，且小鼠實驗的結果符合預期：ASO-cir聯(lián)合ASO-exo確實顯著提高了脾臟原發(fā)病灶中circRHOBTB3的表達，還可顯著減少腫瘤惡病質，且能控制轉移（圖8）。

圖8  ASOs體外及體內實驗

總的來說，這項研究成果闡明了circRHOBTB3調節(jié)細胞間ROS和代謝途徑來抑制CRC的進展的機制，還且提出了一種新的腫瘤逃逸理論，即腫瘤細胞通過“排泄”腫瘤抑制circRNA來維持癌細胞的活性（“腫瘤外泌體逃逸機制”）。

更重要的是，他們設計的二代ASOs可以通過靶向環(huán)化和分泌來調控腫瘤抑制circRNA，以此促進癌癥的治療效果。且他們的臨床數據顯示，在CRC患者中，85.7%（30/35）的腫瘤樣本攜帶的circRHOBTB3水平低于配對的正常樣本，而腫瘤樣本中circRHOBTB3的低表達與較差的預后相關。這讓我們更加相信，這種ASOs將成為未來針對CRC的一種有前途的治療策略。

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