到目前為止，液體活檢領(lǐng)域主要集中在循環(huán)腫瘤 DNA 和細(xì)胞上，盡管近年來細(xì)胞外囊泡 (EV) 越來越受到關(guān)注。已報道的腫瘤衍生核酸的來源包括白細(xì)胞、血小板和凋亡小體 (AB)，以及大 (LEV) 和小 (SEV) EV。盡管有這些相互矛盾的說法，但目前還沒有一個與血液不同成分相關(guān)的腫瘤衍生DNA的標(biāo)準(zhǔn)化比較。

為了解決這一問題，作者收集了17例KRAS G12基因型突變的胰腺癌患者的23份血液樣本，并根據(jù)取樣后患者的生存時間將其分為兩組。收集紅細(xì)胞和白細(xì)胞后，進(jìn)行差異離心，分離血小板、ABs、LEVs、SEVs和可溶性蛋白(SP)。然后，作者使用電子顯微鏡、Western blotting、納米顆粒跟蹤分析和基于珠的多重流式細(xì)胞術(shù)檢測，確認(rèn)了每個差異離心餾分中特定血液成分的富集。

通過使用數(shù)字PCR技術(shù)靶向野生型和腫瘤特異性KRAS突變等位基因，作者發(fā)現(xiàn)KRAS突變DNA的水平在與LEVs和sev早期以及與sev和SP晚期疾病進(jìn)展相關(guān)時最高。重要的是，作者確定了在整個疾病進(jìn)展過程中，sev在腫瘤來源的DNA中富集最多，并使用尺寸排斥色譜法驗證了這種關(guān)聯(lián)。這項工作通過支持越來越多地關(guān)注 EV 作為腫瘤衍生 DNA 的來源，為快速擴(kuò)展的液體活檢領(lǐng)域提供了重要方向。

圖片來源：https://doi.org/10.1002/jev2.12142

從癌癥患者的外周血中獲取腫瘤來源的DNA的能力可以提供有關(guān)個人疾病的實時信息，而無需進(jìn)行侵入性活檢。這給未來在早期檢測、疾病監(jiān)測和靶向治療方面的應(yīng)用帶來了希望，盡管它還沒有對癌癥患者的護(hù)理產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。但液體活檢領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)之一是血液中存在的微量腫瘤源DNA，特別是在疾病的早期階段。為了克服這個問題，已經(jīng)開發(fā)了基于 PCR 的方法，例如數(shù)字 PCR，以揭示以低于 1000 個分子中 1 個的頻率存在的特定突變等位基因。不幸的是，盡管最近取得了進(jìn)展，但非靶向和多重檢測方法在如此低的等位基因頻率下是站不住腳的。為了解決這個問題，需要對腫瘤DNA最集中的血液成分有更深入的了解。

血液是不同大小成分的復(fù)雜混合物，其中一些成分被認(rèn)為是腫瘤物質(zhì)的儲存庫。例如，循環(huán)的腫瘤細(xì)胞大小不一;可直接從腫瘤中提取，但很少見，且在疾病進(jìn)展期間發(fā)生過晚，因此沒有廣泛的診斷用途。相反，白細(xì)胞和血小板，來自造血系統(tǒng)，并被建議從細(xì)胞外環(huán)境吸收腫瘤物質(zhì)，使其在外周血中可獲得。然而，白血球的研究結(jié)果還沒有在人類身上得到證實，而血小板的研究結(jié)果在該領(lǐng)域受到質(zhì)疑。無論如何，循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)一直是液體活檢研究中最常被引用的靶點，并在可溶性蛋白(SP)復(fù)合物中作為單組蛋白八聚體循環(huán)。盡管還有待證實，但ctDNA被認(rèn)為是從死亡細(xì)胞中釋放出來的，這可能解釋了為什么隨著癌癥向晚期發(fā)展，ctDNA的流行率會增加。

在評估腫瘤來源時，需要考慮的一個問題是，用于診斷的大多數(shù)血漿都經(jīng)過離心處理。這很重要，因為離心會根據(jù)所使用的特定條件去除細(xì)胞和不同類別的細(xì)胞外囊泡 (EV)。細(xì)胞凋亡小體(apoptosis bodies, AB)是在細(xì)胞程序性死亡過程中形成的。微泡由細(xì)胞表面的膜脫落釋放。最后，外泌體由內(nèi)溶酶體系統(tǒng)向內(nèi)出芽產(chǎn)生。盡管外泌體是否含有基因組DNA仍存在爭議，但已有幾項研究證明了它們在診斷中的效用和益處。

全血差速離心法有效分離不同細(xì)胞和囊泡群體

圖片來源：https://doi.org/10.1002/jev2.12142

盡管在分析之前預(yù)先富集腫瘤來源的DNA有好處，但它在血液不同成分中的豐度還有待全面比較。胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種理想的疾病，因為其ctDNA水平高，超過70%的患者攜帶KRAS密碼子12中的兩種特異性突變之一。為了研究疾病進(jìn)展過程中的循環(huán)DNA動態(tài)，作者從17例已知KRAS突變的PDAC患者提供的23份血液樣本中分離出不同成分，并根據(jù)取樣后患者的生存時間將其分為兩組。

利用差異離心和數(shù)字PCR技術(shù)，作者比較了突變型和野生型KRAS DNA拷貝的數(shù)量，并與紅細(xì)胞(RBC)和白細(xì)胞(WBC)、血小板、ABs、大ev (LEV)、小ev (SEV)、SP和10 kD-filter flow (FT)作為陰性對照。該分析顯示，在疾病進(jìn)展早期，LEVs和sev與KRAS突變DNA的數(shù)量最多，而在晚期PDAC患者中，sev和SP含量最多。重要的是，sev與所有血液成分(包括血小板貧乏血漿(PPP))的野生型KRAS突變體的最大富集有關(guān)。因此，這一全面的比較表明，未來的液體活檢研究應(yīng)該關(guān)注ev作為腫瘤來源DNA的主要血源。（世聯(lián)博研(Bioexcellence) Bioon.com）

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