基因，就像是指揮官手里拿著的建筑總圖紙，調(diào)控著生物體的一切生命活動(dòng)。這份施工的圖紙決定了整個(gè)建筑的所有呈現(xiàn)形式。那怎么才能對(duì)“圖紙”——基因進(jìn)行編輯呢？CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)被認(rèn)為是最佳的一種工具。

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院戴磊課題組在ACS Synthetic Biology上發(fā)表最新成果，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了針對(duì)人體腸道擬桿菌的CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，可以對(duì)人體腸道擬桿菌的“圖紙”進(jìn)行修改，具有可進(jìn)行流程化操作和無(wú)篩選標(biāo)記、編輯效率高等特點(diǎn)。團(tuán)隊(duì)成員鄭靈剛和譚揚(yáng)為共同第一作者，戴磊為最后共同通訊作者。

“該方法突破了傳統(tǒng)方法在編輯效率、基因簇刪除和多基因編輯方面的瓶頸，為進(jìn)一步理解腸道微生物組的功能以及活菌藥物的開(kāi)發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。”戴磊表示。

讓CRISPR/Cas“操刀” 打開(kāi)腸道微生物組“窗口”

腸道擬桿菌屬作為腸道中數(shù)量最高的細(xì)菌之一，被視為研究腸道微生物組的“窗口”，研究腸道擬桿菌可以為研究其他腸道微生物提供基礎(chǔ)。此外，擬桿菌屬細(xì)菌也與肥胖、炎癥性腸病和結(jié)直腸癌等多種疾病相關(guān)。目前對(duì)于人體腸道菌擬桿菌屬已有的基因遺傳操作工具存在諸如流程復(fù)雜、編輯效率低等缺點(diǎn)，限制了進(jìn)一步對(duì)腸道菌群和人體健康的研究。

如果可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)腸道擬桿菌的CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，將為研究其他腸道微生物打通“道路”，也為治療人類(lèi)多種疾病提供更多可能性。為了獲得簡(jiǎn)便、高效的遺傳操作工具，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了基于CRISPR/Cas的編輯系統(tǒng)，可以根據(jù)研究者的需要，構(gòu)建無(wú)篩選標(biāo)記的擬桿菌突變株。

那么“操刀”師傅CRISPR/Cas是如何流程化操作的呢？

首先，研究人員使用穿梭質(zhì)粒作為“馬車(chē)” ，讓其攜帶“涂改”工具（剪刀和修復(fù)畫(huà)筆，即Cas基因和修復(fù)模板）進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。在接收到需要涂改的命令（加入誘導(dǎo)劑）后，Cas基因?qū)⒈磉_(dá)出來(lái)的Cas蛋白作為“剪刀”，剪開(kāi)gRNA靶向的基因位置，完成對(duì)目標(biāo)片段的刪除。其次，在有修復(fù)模板（修復(fù)畫(huà)筆）存在時(shí)，隨即可將修復(fù)模板通過(guò)同源重組的方式插入到目標(biāo)位置，完成基因的插入。最后，通過(guò)在培養(yǎng)基中傳代，從而實(shí)現(xiàn)獲得無(wú)篩選標(biāo)記的擬桿菌突變株。利用此方法，可流程化地獲得腸道工程菌，為未來(lái)活菌藥物的設(shè)計(jì)與構(gòu)建提供新的工具。

高效、多功能的基因組編輯工具

擬桿菌屬的傳統(tǒng)編輯工具的效率為4%-25%之間，該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)利用CRISPR/Cas系統(tǒng)，使其編輯效率可以達(dá)到80%-100%。這將極大地促進(jìn)對(duì)腸道菌群和人體健康的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。

“馬車(chē)”、“剪刀”等工具在此過(guò)程中都起著舉足輕重的作用，該團(tuán)隊(duì)在擬桿菌屬中測(cè)試了不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)FnCas12a蛋白（剪刀），可以實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯?；诖?，團(tuán)隊(duì)測(cè)試該系統(tǒng)在多形擬桿菌中可以實(shí)現(xiàn)大片段的刪除和外源基因的高效插入。

“外源基因GFP是一個(gè)熒光蛋白，若能成功插入到基因組中，即可觀察到菌體發(fā)出綠色熒光，供我們查看‘涂改’成功與否?！贝骼诒硎?。

此外，該系統(tǒng)也成功在卵形擬桿菌、脆弱擬桿菌、普通擬桿菌、單形擬桿菌等多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)高效率的基因編輯。

高效、精準(zhǔn)的基因組編輯方法對(duì)于解析腸道微生物組的功能、開(kāi)發(fā)工程腸道益生菌都是不可或缺的工具。與之前針對(duì)擬桿菌屬基因基因遺傳操作工具相比，該團(tuán)隊(duì)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的工具極大的提高了基因編輯的效率，同時(shí)也更容易實(shí)現(xiàn)無(wú)篩選標(biāo)記突變株的獲得。戴磊表示，未來(lái)，該技術(shù)將推動(dòng)腸道菌群與人體健康的機(jī)制研究，有望實(shí)現(xiàn)重大慢性疾病的預(yù)防和治療。(世聯(lián)博研(Bioexcellence)世聯(lián)博研Bioexcellence）

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