雖然兩種CAR-T細(xì)胞療法---諾華公司的tisagenlecleucel（商品名Kymriah）和吉利德公司的axicabtagene ciloleucel（商品名Yescarta）---已被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療白血病和淋巴瘤，但是它們對(duì)占所有癌癥90%的實(shí)體惡性腫瘤的治療效果仍有待臨床證實(shí)。一個(gè)主要的障礙是腫瘤的免疫抑制環(huán)境能阻止T細(xì)胞的浸潤(rùn)、激活和招募。另一個(gè)挑戰(zhàn)是鑒定在癌細(xì)胞表面上選擇性表達(dá)的細(xì)胞表面受體，CAR-T細(xì)胞特異性地靶向該細(xì)胞表面受體，從而使得它們不傷害健康的細(xì)胞和組織。在這方面，癌細(xì)胞表面組（cancer cell surfaceome, 指的是位于癌細(xì)胞表面上的全部大分子）的口袋組（pocketome，指的是在細(xì)胞表面上的每個(gè)大分子中存在的全部結(jié)合位點(diǎn)）部分，包括癌細(xì)胞表面受體及其復(fù)合物上的小分子結(jié)合位點(diǎn)，從而提供了一個(gè)較大的藥物可靶向的空間，該空間只有小分子才能進(jìn)入。因此，小分子可以作為包括抗體在內(nèi)的天然識(shí)別庫的補(bǔ)充。然而，與抗體相比，小分子在癌癥免疫治療中具有不合適的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。人們?cè)噲D利用各種化學(xué)編程抗體、化學(xué)編程雙特異性抗體以及相關(guān)概念解決這些缺點(diǎn)，而且也有人報(bào)道了能夠賦予小分子招募和激活CAR-T細(xì)胞能力的方法。

在利用常規(guī)的抗體Fab片段控制的開關(guān)型CAR-T細(xì)胞平臺(tái)的基礎(chǔ)上，來自美國(guó)國(guó)家癌癥研究所、斯克里普斯研究所和德國(guó)維爾茨堡大學(xué)醫(yī)院的研究人員將這種平臺(tái)調(diào)整為由化學(xué)編程Fab（chemically programmed Fab, cp-Fab）控制。這有效地將對(duì)T細(xì)胞招募和激活的控制轉(zhuǎn)移到靶向癌細(xì)胞表面受體的小分子上。cp-Fab是在體外組裝的，可用于在體外或體內(nèi)激活CAR-T細(xì)胞。這種cp-Fab/CAR-T系統(tǒng)具有高度的通用性，唯一可變的成分是小分子，因此能夠廣泛地利用CAR-T細(xì)胞的力量探究細(xì)胞表面大分子的結(jié)合位點(diǎn)。相關(guān)研究結(jié)果近期發(fā)表在Angewandte Chemie期刊上，論文標(biāo)題為“Chemically Programmable and Switchable CAR‐T Therapy”。

為了對(duì)cp-Fab/CAR-T系統(tǒng)進(jìn)行概念驗(yàn)證，這些作者著重關(guān)注靶向葉酸受體1（FOLR1）的葉酸結(jié)合位點(diǎn)。FOLR1是一種糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的糖蛋白，它以納摩爾的親和力結(jié)合葉酸，從而促進(jìn)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用?？焖偕L(zhǎng)的實(shí)體惡性腫瘤，包括卵巢癌和肺癌，都依賴于葉酸進(jìn)行代謝和核酸合成。為了與健康細(xì)胞和組織競(jìng)爭(zhēng)葉酸，F(xiàn)OLR1在這些癌癥中高度過度表達(dá)。這使得FOLR1成為基于小分子和抗體的診斷和治療試劑---包括CAR-T細(xì)胞和攜帶雙特異性抗體的化學(xué)編程T細(xì)胞---的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。靶向FOLR1的常規(guī)CAR-T細(xì)胞也有報(bào)道，并已轉(zhuǎn)化為用于卵巢癌治療的I期臨床試驗(yàn)。在之前的這些研究的基礎(chǔ)上，這些作者選擇探索FOLR1的葉酸結(jié)合位點(diǎn)作為cp-Fab/CAR-T的代表性靶點(diǎn)。

圖1.cp-Fab系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和概念。圖片來自Angewandte Chemie, 2020, doi:10.1002/anie.202005432。

cp-Fab/CAR-T平臺(tái)是一種雙組分系統(tǒng)，它結(jié)合了（i）cp-Fab，通過重組融合或化學(xué)編程展示一種肽標(biāo)簽；（ii）通用的惰性CAR-T，可結(jié)合這種肽標(biāo)簽（圖1）。CAR-T和cp-Fab是分開給送的，有效地構(gòu)成了一種固有的開啟/關(guān)閉開關(guān)。

cp-Fab是基于催化抗體h38C2構(gòu)建出來的，這種催化抗體在它的11埃深的活性位點(diǎn)底部容納著一個(gè)未質(zhì)子化的賴氨酸（Lys）殘基。這個(gè)Lys的獨(dú)特反應(yīng)性可用于與含有1,3-二酮或β-內(nèi)酰胺的小分子進(jìn)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。在化學(xué)編程抗體中，h38C2作為不變的生物組分，可與靶向細(xì)胞表面受體的小分子結(jié)合位點(diǎn)的可變化學(xué)組分共價(jià)結(jié)合。

這些作者建立了兩種不同類型的cp-Fab。在第一種cp-Fab中，將一個(gè)非免疫原性的源自酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4的短肽（NYHLENEVARLKKL，下稱GCN4肽）重組融合到h38C2 Fab支架的重鏈（HC）和輕鏈（LC）的C端（CT）或N端（NT）。根據(jù)這種肽標(biāo)簽的位置，將這些標(biāo)記的Fab稱為HCCT、HCNT、LCCT和LCNT（圖1a）。第二種cp-Fab使用未標(biāo)記的或者說野生型的h38C2 Fab支架，通過化學(xué)編程獲得招募CAR-T細(xì)胞所需的GCN4肽。

圖2.靶向FOLR1的化合物的結(jié)構(gòu)。圖片來自Angewandte Chemie, 2020, doi:10.1002/anie.202005432。

三官能團(tuán)β-內(nèi)酰胺-生物素-葉酸化合物1（圖2a）用于對(duì)這四種標(biāo)記的Fab進(jìn)行化學(xué)編程。β-內(nèi)酰胺基團(tuán)介導(dǎo)半抗原驅(qū)動(dòng)的高效和選擇性地共價(jià)偶聯(lián)到h38C2活性位點(diǎn)的反應(yīng)性Lys上。生物素基團(tuán)使得檢測(cè)成為可能。葉酸基團(tuán)介導(dǎo)FOLR1結(jié)合。流式細(xì)胞儀分析顯示，兩種在C末端攜帶肽標(biāo)簽的cp-Fab（HCCT_1和LCCT_1）結(jié)合表達(dá)FOLR1的人卵巢癌細(xì)胞IGROV-1和SKOV-3。相比之下，對(duì)應(yīng)的未經(jīng)過化學(xué)編程的Fab并不能結(jié)合這兩種癌細(xì)胞。重要的是，實(shí)驗(yàn)證實(shí)共價(jià)偶聯(lián)的化合物1并不干擾cp-Fab/CAR-T相互作用。WT Fab_2、WT Fab_3、WT Fab_4和WT Fab_5均與CAR-T細(xì)胞以及IGROV-1和SKOV-3細(xì)胞結(jié)合，而未經(jīng)過化學(xué)編程的WT Fab不與其中的任何一種細(xì)胞結(jié)合。

為了研究cp-Fab/CAR-T系統(tǒng)在體內(nèi)的活性，他們使用人卵巢癌的小鼠模型。這種小鼠模型是通過將經(jīng)過螢火蟲熒光素酶編碼基因轉(zhuǎn)染的IGROV-1細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到NSG小鼠中而構(gòu)建出的。不論是在體內(nèi)，還是在體外，這種靶向細(xì)胞表面受體葉酸結(jié)合位點(diǎn)的cp-Fab/CAR-T系統(tǒng)能夠特異性地和強(qiáng)效地清除表達(dá)FOLR1的癌細(xì)胞。（生物谷 世聯(lián)博研Bioexcellence）

小編推薦會(huì)議  2021（第十二屆）細(xì)胞治療線上國(guó)際研討會(huì)

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