CAR-T細(xì)胞療法是一種過繼細(xì)胞療法 (adoptive cell therapy)。2017年，Novartis和Kite的兩款CAR-T產(chǎn)品相繼獲批給細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究者注入了一劑強心劑。作為一種“產(chǎn)品”，圍繞CAR-T的專利壁壘可能存在于整個生產(chǎn)過程的哪些環(huán)節(jié)中呢？我們嘗試在本篇中進(jìn)行一些探討。

CAR-T專利面面觀

CAR-T細(xì)胞療法

CAR-T細(xì)胞是一種經(jīng)基因工程化的T細(xì)胞，通常表達(dá)能識別特定腫瘤抗原的CAR (chimeric antigen receptors，嵌合抗原受體)，進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)以消滅腫瘤。CAR通常包含三個結(jié)構(gòu)域：識別腫瘤相關(guān)抗原的胞外域 (如，scFv)、信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (例如，CD3 zeta)和一個或多個胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域 (例如，可源自CD28、4-1BB、OX40等)。

目前，CAR-T主要用于治療血液腫瘤 (如B細(xì)胞惡性腫瘤)，其中靶向CD19的CAR-T療法已取得了激動人心的治療效果，而人們也在嘗試用CAR-T來治療其它類型的血液腫瘤，甚至實體瘤。

2017年8月和10月，F(xiàn)DA相繼批準(zhǔn)了Novartis和Kite的CAR-T產(chǎn)品KYMRIAH？ (tisagenlecleucel)和YESCARTA？ (axicabtagene ciloleucel)，這兩款產(chǎn)品都是靶向CD19的CAR-T細(xì)胞。

目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的兩款產(chǎn)品都是利用患者自身的T細(xì)胞進(jìn)行修飾的，這種方法的優(yōu)點是較少出現(xiàn)免疫原性問題，制備過程可以簡單描述如下：

將來自患者自身的T細(xì)胞在離體 (ex vivo)條件下經(jīng)過基因工程的方法進(jìn)行修飾和擴增后得到所需的CAR-T細(xì)胞，然后回輸至患者體內(nèi)。主要包括以下步驟：

步驟1：利用白細(xì)胞分離術(shù)收集白細(xì)胞，進(jìn)一步分離并富集T細(xì)胞

步驟2：培養(yǎng)步驟1中獲得的T細(xì)胞，利用人造抗原呈遞細(xì)胞活化T細(xì)胞，并施加裝載有CAR核酸序列的病毒載體

步驟3：在生物反應(yīng)器中擴增T細(xì)胞

步驟4：對擴增產(chǎn)物進(jìn)行洗滌并濃縮

步驟5：經(jīng)過質(zhì)控和審查后，對產(chǎn)品進(jìn)行冷凍保存

步驟6：產(chǎn)品經(jīng)解凍輸注至患者體內(nèi)

下面我們就以中國的專利保護(hù)情況為例，來看看上面這個過程中可能在哪些環(huán)節(jié)存在何種專利壁壘。

T細(xì)胞富集環(huán)節(jié)

Juno于2015年申請的中國專利CN106459917A涉及一種T細(xì)胞富集方法，例如，權(quán)利要求1請求保護(hù)：

“一種富集CD4+或CD8+T細(xì)胞的方法，所述方法包括： (a) 在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行第一選擇，所述第一選擇包括：從包含原代人Τ細(xì)胞的樣品中針對 (i)CD4+細(xì)胞和 (ii)CD8+細(xì)胞之一進(jìn)行富集，所述富集由此產(chǎn)生第一選擇群和未選擇的群；和 (b) 在所述封閉系統(tǒng)中進(jìn)行第二選擇，所述第二選擇包括：從所述未選擇的群中針對 (i)CD4+細(xì)胞和 (ii)CD8+細(xì)胞中另一者進(jìn)行富集，所述富集由此產(chǎn)生第二選擇群，其中，所述方法產(chǎn)生富集的組合物，其針對CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞富集，并且包括第一選擇群的細(xì)胞和第二選擇群的細(xì)胞?！?/span>

可見，該方法涉及如何從人Τ細(xì)胞的樣品中，分別針對CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞進(jìn)行篩選和富集。

病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)

Juno的另一個中國專利申請CN107109438A涉及病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。其中，權(quán)利要求1如下：

“一種轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，其包括：在離心室的內(nèi)部空腔中孵育輸入組合物，該輸入組合物包含細(xì)胞及含有重組病毒載體的病毒顆粒，其中該離心室能圍繞旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)，并且包含端壁、自該端壁延伸的基本上剛性側(cè)壁及至少一個開口，該側(cè)壁的至少一部分包圍該內(nèi)部空腔，且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內(nèi)部空腔中及液體自該空腔壓出；該離心室在該孵育的至少一部分期間圍繞該旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)；及該方法產(chǎn)生輸出組合物，該輸出組合物包含用該病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個細(xì)胞?！?/span>

這個權(quán)利要求描述的就是一種在特定裝置中，用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法，最后獲得經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。

細(xì)胞擴增環(huán)節(jié)

再來看一個Juno的中國專利申請CN106414724A，其涉及一種細(xì)胞擴增方法，權(quán)利要求1如下：

“一種擴增細(xì)胞群的體外方法，其包括使包含細(xì)胞群的樣品與多聚化劑接觸，其中，所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級激活信號的第一試劑；其中，所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合，其中，所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及其中，所述第一試劑與細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級激活信號從而激活細(xì)胞。”

可見，這個權(quán)利要求描述的是利用多聚化劑來激活細(xì)胞，從而使細(xì)胞群擴增的方法。

CAR或CAR-T

CAR的結(jié)構(gòu)組成決定了T細(xì)胞結(jié)合的抗原種類，進(jìn)而刺激T細(xì)胞發(fā)揮治療作用，因此，圍繞“CAR”和加載了“CAR”的T細(xì)胞的專利申請可謂是最重要的一類專利。

例如，Novartis的一篇中國專利申請CN105392888A涉及編碼嵌合抗原受體的核酸分子，權(quán)利要求1如下：

“編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離核酸分子，其中該CAR包含包括人源化抗CD19結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體或抗體片段、跨膜結(jié)構(gòu)域、和包含刺激結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中所述抗CD19結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含表3所列任何抗CD19輕鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的輕鏈互補決定區(qū)1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區(qū)2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區(qū)3(LC CDR3)之一個或多個、以及表3所列任何抗CD19重鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的重鏈互補決定區(qū)1(HC CDR1)、重鏈互補決定區(qū)2 (HC CDR2)和重鏈互補決定區(qū)3 (HC CDR3)之一個或多個?！?/span>

可見，其限定了CAR包含結(jié)合CD19抗原的人源化結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體或抗體片段，并進(jìn)一步限定了輕鏈和重鏈的序列。

再例如，賓夕法尼亞大學(xué)遞交的一篇中國專利申請CN106220739A也涉及CAR，其權(quán)利要求1如下：

“分離的嵌合抗原受體(CAR)，其包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原，所述腫瘤抗原選自CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F(xiàn)77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR和其任何組合；和/或所述共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結(jié)合的配體和其任何組合?！?/span>

可見，該權(quán)利要求中，對抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)的限定都相當(dāng)寬泛，相信后續(xù)審查過程中將通過修改進(jìn)一步限定。

賓夕法尼亞大學(xué)的另一個中國專利申請CN107206024A涉及一種經(jīng)修飾的T細(xì)胞，其權(quán)利要求1如下：

“修飾的T細(xì)胞，其包括：能夠下調(diào)內(nèi)源基因的基因表達(dá)的核酸，所述內(nèi)源基因選自TCRα鏈、TCRβ鏈、β-2微球蛋白、HLA分子、CTLA-4、PD1和FAS；和編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受體(CAR)包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?！?/span>

可見，該專利申請涉及的是通用型CAR-T (allogeneic CAR-T)細(xì)胞，其中通過下調(diào)某些內(nèi)源基因的表達(dá)而降低免疫原性，以期提供“off-the-shelf”的CAR-T產(chǎn)品。

當(dāng)然，說到通用型CAR-T細(xì)胞，就一定要提到Cellctis公司，Cellectis利用TALE-核酸酶基因編輯技術(shù)敲除T細(xì)胞中表達(dá)T細(xì)胞受體 (TCR)的基因而開發(fā)了通用型CAR-T。例如，Cellctis公司在中國遞交了專利申請CN104718284A，其權(quán)利要求1如下：

“一種制備用于免疫療法的T細(xì)胞的方法，包括：(a)通過滅活至少以下各項改變T細(xì)胞：表達(dá)免疫抑制劑的靶標(biāo)的第一基因，和編碼T細(xì)胞受體(TCR)的組件的第二基因，(b)可選地在所述免疫抑制劑的存在下，擴增所述細(xì)胞。”

滅活表達(dá)免疫抑制劑靶標(biāo)的基因是為了提高工程化T細(xì)胞對免疫抑制藥物的耐受性，而滅活編碼TCR的組件的基因是為了降低移植物抗宿主反應(yīng)，這些都為通用型CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

質(zhì)控環(huán)節(jié)

賓夕法尼亞大學(xué)遞交的另一個中國專利申請CN104619723A涉及分析基因修飾的T細(xì)胞中污染物的方法，其權(quán)利要求1如下：

“分析基因修飾的T細(xì)胞以檢測污染物的方法，其中所述基因修飾的T細(xì)胞包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?！?/span>

可見，該方案涉及的是對所獲得的細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。

治療方法、用途及藥物組合物

例如，Juno的中國專利申請CN107106610A涉及一種治療方法及相應(yīng)的藥物組合物，其權(quán)利要求77如下：

“一種包含用于治療對象中疾病或病癥的表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的細(xì)胞的組合物，其中所述細(xì)胞經(jīng)配制和/或包裝用于以第一和連續(xù)劑量給予對象和/或所述治療包括以第一和連續(xù)劑量向?qū)ο蠼o予細(xì)胞，其中：

所述第一劑量包含不超過約1x106個細(xì)胞/千克對象體重，不超過約1x108個細(xì)胞，和/或不超過約1x108個細(xì)胞/m2對象，并且

所述連續(xù)劑量選自：

i)用于在以下時間點給予的連續(xù)劑量：(a)第一給予開始后至少或超過約14天后并且不到約28天，和/或(b)(i)所述對象中指示細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)的因子的血清水平是所述第一給予之前即刻的所述對象中的不到約10倍，不到約25倍，和/或不到約50倍；(ii)所述對象沒有顯示3級或更高神經(jīng)毒性；(iii)所述給予第一劑量后所述對象中的神經(jīng)毒性的癥狀或CRS-相關(guān)結(jié)果已經(jīng)達(dá)到峰值水平并且在所述第一給予之后開始下降，和/或(iv)所述對象沒有顯示針對所述第一劑量的細(xì)胞表達(dá)的CAR的可檢測的體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；和

ii)包含與第一劑量中的CAR-表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量大約相同數(shù)量的CAR-表達(dá)細(xì)胞的連續(xù)劑量，或與第一劑量相比數(shù)量增加的CAR-表達(dá)細(xì)胞的連續(xù)劑量。”

由于治療方法在中國是非授權(quán)主題，權(quán)利要求寫成上述模樣也真是挺難為專利律師的。

組合拳

上面介紹的多是涉及生產(chǎn)的某個環(huán)節(jié)的專利，而Kite的中國專利申請CN106459915A則涉及了從細(xì)胞富集到細(xì)胞擴增的整個制備過程，例如，權(quán)利要求1如下：

“一種制造表達(dá)細(xì)胞表面受體的T細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞表面受體識別靶細(xì)胞表面特定抗原部分，所述方法包括：富集獲自供體對象的淋巴細(xì)胞群體；用一種或多種T細(xì)胞刺激劑刺激所述淋巴細(xì)胞群體，從而產(chǎn)生激活的T細(xì)胞群體，其中所述刺激是使用無血清培養(yǎng)介質(zhì)在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行的；用包含編碼所述細(xì)胞表面受體的核酸分子的病毒載體對所述激活的T細(xì)胞群體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用單循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞群體，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)是使用無血清培養(yǎng)介質(zhì)在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行的；對所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞群體擴增預(yù)定的時間以產(chǎn)生工程化T細(xì)胞群體，其中所述擴增是使用無血清培養(yǎng)介質(zhì)在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行的。”

雖然，大部分CAR-T領(lǐng)域的中國專利申請尚未獲得授權(quán)，但鑒于主要玩家們在其它國家和地區(qū)的專利糾紛不斷，在中國進(jìn)行CAR-T研發(fā)的企業(yè)們還是應(yīng)該密切關(guān)注各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的重要專利，盡早鑒別出可能的法律風(fēng)險并合理應(yīng)對。此外，該領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)狀況錯綜復(fù)雜，專利申請非常密集，進(jìn)行CAR-T研發(fā)的企業(yè)在相關(guān)專利申請和布局方面，也應(yīng)只爭朝夕。(生物谷Bioon.com）